杰丁塞伯林德纳氏酵母CRISPR_Cas9基因编辑系统开发及其在异源甾醇生产菌株改造中的应用.pdf

摘要

摘要

杰丁塞伯林德纳氏酵母（Cyberlindnerajadinii•CJ）是美国食品和药物管理局

FDAGRAS

（）认证的安全菌种，已在食品和饲料行业使用了近一个世纪，是重要

的工业生产酵母。杰丁塞伯林德纳氏酵母属于Crabtree-阴性酵母，具有强大的呼吸能

力，生长快速，因此常被用来生产蛋白（单细胞蛋白，各种工业酶）以及一些高附加

β-

值天然产物（如葡聚糖，生物素，类胡萝卜素等）。由于杰丁塞伯林德纳氏酵母属

于四倍体酵母，应用传统的遗传操作工具对其进行遗传改造需要四轮操作才能完成，

费时费力。因此有必要开发更为简单高效的遗传操作工具，使该酵母的工业应用潜能

进一步得到释放。CRISPR/Cas9基因编辑系统是高效的基因编辑工具，具有编辑效率

高，可同时编辑多个等位基因，以及无痕编辑等特点。该技术经过近些年的发展，已

广泛应用于各种非常规酵母的遗传改造。由于CRISPR/Cas9基因编辑系统还没在杰

丁塞伯林德纳氏酵母中建立，本课题着重开展了相关开发工作。

本课题首先设计并构建了可应用于杰丁塞伯林德纳氏酵母CICC#1769菌株基因

编辑的一元CRISPR/Cas9质粒pCJ-Cas9-sgRNA-G418。该质粒由六个独立模块组成，

M1f1DNAf1oriM2G418R

包括（）含有噬菌体的复制原点（）的模块；（）抗性筛

M3ARSM4

选标记模块；（）杰丁塞伯林德纳氏酵母自主复制序列（）模块；（）用

Pro

内源tRNA（UGG反密码子）启动子驱动的单向导RNA（SgRNA）表达模块；（M5）

oriM6

质粒复制起点（）和氨苄青霉素抗性筛选标记模块；（）用内源核苷二磷酸还

原酶CjRNR2启动子驱动的化脓性链球菌SpCas9基因表达模块。用该质粒敲除

CICC#1769菌株中的磷酸核糖氨基咪唑羧甲基化酶编码基因ADE2，发现一次转化同

时敲除掉四个ADE2等位基因的效率可达85%。为进一步提升基因编辑效率，本课题

pCJ-Cas9-sgRNA-G4181

随后对质粒中的一些关键元件进行优化：（）通过测试不同

长度和来源的自主复制序列，发现分离自杰丁塞伯林德纳氏酵母核染色体上的1.9Kb

ARS12tRNA

长度的对维持质粒的稳定性效果最好。（）通过测试不同内源启动子

sgRNAtRNA3

驱动表达的能力，发现不同启动子具有相似的基因编辑效率。（）发

现用THD3（编码糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶）组成型强启动子驱动SpCas9

核酸表达可显著提升基因编辑效率至100%。最终整合优化元件的质粒被命名为

pCJ-Cas9-sgRNA-G418-II。本课题其次测试了基因组杂合位点对基因编辑效率的影

响。借助2%w/v葡萄糖生长条件下的RNA-seq转录组数据，本课题发现CICC#1769

菌株核基因组呈现“AAAB”核型并存在大量杂合位点。本课题通过在ADE2基因中选

20ntspacerS1S21

择特殊位置的间隔序列（