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浅析细菌内毒素检测方法及常见问题;内 容

·细菌内毒素简介

·细菌内毒素检测方法

·常见问题及解决方案;一、细 菌 内 毒 素 简 介;·主要来源;·主要特性（实验器材处理方法）;·主要特性（实验器材处理方法）;·主要特性（去除内毒素方法）;·热原=内毒素 ？

热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。;·热原检查方法简介

《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进行检查。;热原检查法;·与热源对比内毒素检查法优势;·在药检中的应用

细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，已经广泛的被世界各国药典收载。;二、细菌内毒素检测方法;鲎试剂与内毒素反应机理;名词解释1—鲎及鲎试剂;名词解释2—国家标准品及工作标准品;名词解释3—细菌内毒素检查用水;细菌内毒素检测之凝胶法;·实验材料及用具

1、仪器;·试剂

1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号

2、内毒素工作标准品

3、内毒素检查用水

4、75％乙醇;·灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。

试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支；待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。;0.2ml;2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入;·反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动;左侧管旋转180°凝胶不能保持完整为阴性，记为“－”；右侧管旋转180°凝胶不变形为阳性，记为“＋”。;举例：;·方法学验证—供试品干扰预试验

目的：

确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强），得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，为正式干扰实验提供依据。

影响因素：

—新药检查方法建立；

—鲎试剂批号或来源的改变；

—检品生产工艺，配方，成分的改变；

—检品关键成分来源的改变；;方法学验证—供试品干扰预试验;方法学验证—供试品干扰预试验;·方法学验证—供试品干扰预试验;·方法学验证—供试品干扰试验;·方法学验证—供试品干扰试验

结果判定：;·供试品细菌内毒素凝胶法检测;三、常见问题及解决方案;3、实验条件达不到要求

实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，应备有一台超净工作台。

4、温度不符合要求

实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为37±1为宜。

5、忽视样品本身干扰;供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。;(2).物理方法

如加热法(血液制品)、冷析法(甘露醇 )(3).化学方法

如调节PH值(奎诺酮类)、调节金属离子(血液保养液、FDP)

(4).生物方法

如抗增液的使用，阻断G因子反应，防止假阳性；(5).其它方法

如过滤法、溶剂抽提等;6、鲎试剂浓度达不到要求

开启内毒素标准品和鲎试剂时，要将粘附在安瓿壁上的粉末尽可能地弹落下去。用砂轮划过安瓿后，要用酒精棉（最好能用沾异丙醇的无纺布，以避免产生假阳性结果）擦拭，防止开启时玻璃屑落入安瓿内。开启内毒素标准品时，要在安瓿曲颈上部，并尽可能保留较长的安瓿颈，准确加入1.0ml鲎试验用水复溶。;7、细菌内毒素混合不均匀

（1）.内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器混合15分钟，以后的每一步稀释前要至少混合30秒，

其它国家药典也有类似要求；

（2）.具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布。不按要求进行旋涡混合器混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照

不凝等不正确的实验结果。;振荡前;8、对灵敏度标示值的误解

如λ=0.06EU/ml，实际上表示的灵敏度λ