生化技术固定化的酶与微生物.ppt

●酶固定化以后，活性降低的原因：（1）酶蛋白空间构象改变，空间位阻效应增加，而酶的催化活性与其特定的空间结构密切相关；尤其是共价结合法和交联法（酶的活性基团参与反应）对空间结构的影响更大（2）酶与载体偶联后产生的空间位阻效应降低了酶分子周围的底物浓度，减少了酶与底物接触的机会；使反应减慢，表现出酶活力下降（3）包埋法中凝胶通透性的影响，使酶与底物的接触受到限制另外，有些固定化酶(或微生物)相对活力的大小，还会受到底物与载体性质、酶的类型、酶量以及制备方法等因素的影响第29页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三第30页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三（二）活力曲线与最适pH值固定化酶(或微生物)的活力曲线与最适pH值的变化：酶(或微生物)固定化后，其活力曲线和最适pH值，一般会发生偏移活力曲线和最适pH值偏移的原因：①酶固定化后，部分氨基酸侧链和酶分子的净电荷发生了改变，随之酶活性基团的解离值(pK)也改变；而酶的活性与其解离状态相关；②由于载体的理化性质受到影响，致使固定化酶颗粒扩散层内外的[H+]浓度产生差异，其中多阴离子衍生物载体带负电荷，最适pH值向碱侧偏移，而多阳离子衍生物载体带正电荷，最适pH值则向酸侧偏移；③酶反应产物导致固定化酶颗粒内带电微环境的改变（在大多数情况下，固定化酶的活力曲线要比游离酶陡峭）第31页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三②的解释：在固定化酶反应体系中，酶颗粒周围存在一个极薄的扩散层，带电的载体使固定化酶微环境中的带电状态不同与外环境。带负电荷的载体会使料液中H+局部集中于扩散层，使固定化酶微环境的PH值低于外侧料液的PH值；为了抵消这种影响，需提高料液的PH值，才能使固定化酶达到最大的催化速度；所以，带负电荷的载体通常使固定化酶的最适PH值向碱侧偏移，而带正电荷的载体则通常使固定化酶的最适PH值向酸侧偏移第32页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三活力曲线和最适pH值偏移的表现第33页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三综上情况可以看出，酶(或微生物)经固定化后，其活力曲线和最适pH的变化是有一定规律的。因此，当酶的最适pH与其所处的环境pH不相同时，可通过选择适当的载体进行固定，以改变其最适p值，使之与环境相一致，从而使固定化酶活力达到最大。第34页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三特点：①固定化酶的稳定性一般都优于游离酶；②固定化微生物的稳定性，基本上与固定化酶相近。固定化酶稳定性提高的原因可能是：带电荷载体与酶分子之间产生了静电作用，对酶的特定空间构象起到稳定作用蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化现象发生固定化以后，由于空间位阻，降低了变性剂、解离剂、有机溶剂等对酶的进攻破坏作用（三）稳定性第35页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三第36页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三（四）米氏常数●米氏常数（Km）是酶的一个特征性常数，每一种酶都有一定的Km值，其倒数1/Km称为亲和常数，用来表示酶与底物的亲和力；而固定化酶的Km值和最大反应速度（Vm）常因酶蛋白结构的变化和载体带电荷的影响而变化。此外，随着反应体系离子强度的增大，或者载体粒度的增大，米氏常数也会增大。一般，载体的颗粒越小，固定化酶越接近游离状态的酶，米氏常数就越接近。●固定化酶的最大反应速度与游离酶相比，要依具体情况而定。大多数酶经固定化以后，Vm变化不大，但也有由于固定化方法不同而有差异的。如：以多孔玻璃为载体共价结合的转化酶，其Vm与游离酶相同；但用PEAE凝胶包埋的转化酶，其Vm却只相当于游离酶的1/10。第37页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三（五）其他1、PH值的影响：酶用带正电荷的载体固定时，在偏酸性环境条件下可增加固定化酶的稳定性；相反，酶用带负电荷的载体固定时，在偏碱性环境条件下可增加固定化酶的稳定性2、酶固定化以后，抗氧化能力增强3、固定化微生物，如含精氨酸脱亚胺酶的恶臭假单包菌，用PEAE凝胶包埋后，由于细胞膜结构发生改变，导致其对底物（S）和产物（P）的选择性丧失，从而提高了固定化微生物的相对活力第38页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三六、应用固定化酶(或微生物)比游离酶(或自然微生物)不但稳定性好，而且与底物和产物更容易分开，所以在工业、医学、药学和生化分析等方面的应用发展较快第39页，讲稿共56页，2023年5月2日，星期三