超滤亲和—液质联用技术筛选中药抗凝血酶活性成分研究.docVIP

超滤亲和—液质联用技术筛选中药抗凝血酶活性成分研究

目的:凝血酶是抗凝血的重要靶点,新型口服抗凝药直接作用于凝血酶发挥抗凝作用。新型口服抗凝药具有出血、缺乏特异对抗剂、漏服发生严重并发症等严重不良反应。

丹参作为活血化瘀最常用的中药,目前研究表明其成分具有较强的抗凝血作用,当归常与丹参配伍的用作活血抗凝,因此选择丹参和当归作为超滤亲和筛选对象。本文拟建立超滤亲和凝血酶抑制剂筛选方法,快速高通量筛选中药中抗凝血酶成分。

对丹参、当归的成分进行凝血酶结合后的超滤筛选,并通过质谱进行鉴定和抗凝血活性测定确定抗凝血酶活性成分。而后通过活性验证及等温滴定量热技术对丹参和当归中抗凝血酶活性成分进行机制研究,以期确认其抗凝活性并探究其抗凝血酶机制。

方法:1.建立基于超滤亲和技术的抗凝血酶活性成分筛选方法,考察不同孵育时间及孵育温度对方法的影响,并考察凝血酶的溶剂耐受性。2.通过UPLC法分离丹参、当归的醇提物和水提物,建立其指纹图谱。

3.通过UPLC-LTQ-Obitrap-MSn质谱仪对丹参、当归成分进行鉴定,而后通过建立的超滤亲和筛选方法对丹参、当归进行抗凝血酶活性成分筛选。4.通过生色底物法验证筛选成分的抗凝血酶活性并通过等温滴定量热仪(ITC)测定潜在抗凝血酶活性成分与凝血酶的滴定曲线,分析热力学参数,并探讨潜在活性成分的作用机制。

结果:1.本文成功建立超滤亲和抗凝血酶活性成分筛选