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高效液相色谱仪使用中的注意事项

在现代仪器分析中，作为色谱分析的重要分支，高效液相色谱已得到日益广泛的应用。它与气相色谱相比较其基本原理是相同的，因结构和工作方式等特点而具有使用上的特殊性，它是以液体为流动相，不受样品的挥发性和热稳定性的限制，对样品的适应性广，适用于在生物学和医药上有重要意义的大分子、不稳定的天然产物及高分子量化合物、离子型物质的分析。

高效液相色谱仪从结构上大致可分为输液泵、进样器、色谱柱及柱温箱、检测器等单元。储液器中存储的除气载液经过滤后由高压泵输送到色谱柱入口，梯度洗脱时为单（双泵）送液，样品由进样器注入载液系统，送到色谱柱进行分离，分离后的组分由检测器检测，输出信号供给记录或数据处理设备。以下按流动相的流路顺序以等度系统为例分别对各单元加以说明。

一、 流动相

液相色谱所用流动相根据分析目的可分为单一或混合流动相，固定相一定时，流动相的种类、配比都严重影响分离效果，最好使用重蒸馏水或HPLC级的有机试剂。依据其所流过单元的特殊性，在使用前必须对其进行过滤和脱气处理。过滤的目的是除去其中微米级的机械杂质，以避免系统污染、磨损和堵塞。脱气则是除去溶解或因混合而产生的气泡，以免引起流量和压力的稳定性及检测器的噪声，最终导致分析数据的重现性变差。应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂，流动相对试样有适宜的溶解度，本身粘度要小，与所用检测器相匹配。

韦氏滤瓶是目前过滤流动相的最常用工具，常用滤膜有0.22微米和0.45微米，又分为有机系和水系两种，过滤不同的试剂应使用相应的过滤膜。在处理混合流动相时，应先过滤后混合，还要注意操作过程中的防尘。

脱气的方法有多种，综合效果和成本而言，在等度分析中常用超声波清洗器完成一般脱气，脱气后的流动相在使用前应注意密封和温度的平衡。严格讲应使用在线脱气装置，有膜脱气和氦气脱气两种。流动相应在使用前进行过滤和脱气处理。试样也必须过滤，可用一次性针头式过滤器完成。

废液的处理应注意污染问题，可采用燃烧或掩埋等方法。

二、溶剂输送泵

因固定相粒度细，流动相具有一定的粘度，必须借助高压泵强使流动相以一定的速度通过柱子。泵的性能直接影响分析过程的稳定性和结果的精密度，它将单一或混合流动相依据分析目的不同以恒流、恒压或等（变）梯度的方式送入系统中。梯度洗脱是在分离过程中让含有两种或两种以上溶剂组成的流动相按一定程序连续变化，产生相应的浓度梯度、极性梯度、离子梯度和PH值梯度，可改善分离、加快分析速度、提高柱效，有利于痕量组分的检测，保持柱性能长期良好，但不同溶剂的紫外吸收程度稍有差异，能引起基线漂移。泵的结构以串联双柱塞和微体积双柱塞为主，使用脉动阻尼器可减少流量的脉动，可用0.1mmX2m不锈钢管作阻尼管。其液腔体积小，易清洗和更换溶剂。

在使用中注意色谱柱所能承受的最高压力，不得超过其上限。使用缓冲盐作流动相时，分析完成后立即用不含盐流动相或处理后的重蒸馏水冲洗泵单元及整个系统，防止盐结晶析出而加速系统磨损造成的漏夜和系统的堵塞。

送液前应注意使用排液（开关）阀排出泵前的气泡或旧流动相。在使用中若不断有气泡被吸入，检查吸滤器与管路及管路与泵入口处是否漏气，否则拆洗或更换吸滤器。

三、进样系统

因工作在压力较高的状态下，常用手动高压六通进样阀完成进样，如：

7725i，标准配置为20微升定量环。废液瓶中排液管出口应水平于进样口的针平面，避免虹吸产生的污染和取样误差。在全量进样时，取样体积是所用定量环容量的三倍以上，取样器中不得有气泡存在。

必须避免发生样品交叉污染，注射不同试样前应用流动相清洗进样阀针口。推荐的进样操作顺序为：在进样状态插入注射器，扳动手柄至取样状态，匀速推入试样，快速将手柄扳至进样状态。平时应保持进样阀针口密封圈处于扩张状态，以延长其寿命。

四、色谱柱

液相柱色谱按其分离原理分为吸附、分配、离子交换、空间排阻等，每种使用的固定相和流动相种类不同，应用范围也有差异。

吸附色谱是以液体为流动相，固定相则是固体吸附剂，待测组分的分子因与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的吸附能力的差别而分离，吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，导致保留时间的不同，使各组分彼此分离，由于吸附剂的活性中心常按一定几何规律排列，此法常用于结构异构体组分的分离。

分配色谱中流动相和固定相都是液体，利用被分离组分在固定相和流动相中的溶解度不同而导致分配系数差别进行分离。它分为正相液一液色谱和反相液一液色谱：正相即固定相的极性大于流动相的极性，样品中极性小的组分先流出，适用于分离容易溶于有机溶剂的强极性及中等极性的分子型物质，主要用于含有不同官能团物质的分析；反相即流动相的极性大于固定相的极性，样品中极