黄芪内生真菌实验方案.docxVIP

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1试剂

蔗糖；琼脂粉；蒸馏水（取自山西大同大学实验室制取）；NaNO3固体颗粒;K2HPO4-3H2O固体颗粒；KCL固体颗粒；MgSO4-7H2O固体颗粒；FeSO4-7H2O固体颗粒；无水乙醇；乙酸乙酯；丙酮；1mol/LNaOH溶液；1mol/LHCL溶液;

2.1.2菌种

二十株内生真菌

四株腐败菌

2.1.3仪器和设备及实验材料

SW-CJ-2F双人双面超净台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），

高压灭菌锅（北京维欣仪奥科技发展有限公司），

电炉（深圳市鼎鑫设备有限公司），

HPX-9272MBE生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），

摇床，镊子一个，酒精灯一个，培养皿（直径60mm）若干，三角瓶（250mL）若干，接种环一个，烧杯（量程为1L）若干，

剪刀一把，医用酒精棉，小刀一个，无菌滤纸若干

2.2实验方法

2.2.1培养基的制备

（1）察式培养基的配制

称取NaNO3固体颗粒3g；K2HPO4?3H2O固体颗粒1g；KCL固体颗粒0.5g；MgSO4?7H2O固体颗粒0.5g；FeSO4-7H2O固体颗粒0.01g；加入500ml蒸馏水搅拌溶解；

加入30g蔗糖，然后加入琼脂糖20g，再将混合液置于电炉上加热，不停的搅拌。待液体沸腾后，注意控制电炉温度防止溢出。并用玻璃棒不停的搅拌，使琼脂糖完全溶解。

冷却全常温，调节PH为7.3±0.2，倒入三角瓶（加入的培养基不能超过2/3）中待灭菌⑶。

2.2.2培养基、实验用具的灭菌

将配制的察式培养基所倒好的三角瓶用报纸封口，并用棉线系好；将200mL蒸馏水倒入2个三角瓶用报纸封口，并用棉线系好；

将镊子，手术刀，剪刀用报纸包好用棉线系好；

洗40个直径6mm的培养皿待晾十后，用报纸包好并用棉线系好。将用报纸包好的实验用品全部放入高压蒸汽灭菌锅进行高压灭菌。在121°C灭菌20min，保存。

2.2.3内生真菌、指示菌的活化、固体培养

将培养基取出，融化后放入超净台，并将无菌滤纸放入超净台，开启超净台的紫外灭菌。待培养基稍冷却后，进行超净台的无菌操作，先关闭紫外灭菌，然后将培养基倒到培养皿制成平板，24个培养皿，每皿10ml，待培养基平板冷凝制的平板。

在超净操作台上，先在火焰上灼烧接种环至烧红，冷却一会，在平板培养基边缘试温后，使用接种环分别将20株解冻的内生真菌接种到20个察式培养基平板中，分别将2种指示菌(食物腐败菌)接种到4个察式培养基平板中，每株接种两个平板，并贴标签，置于26C恒温培养箱中培养3天。

2.2.4天然防腐剂产生菌的初筛

用平板对峙法对20株内生真菌进行初筛

在超净操作台上，使用5mm打孔器在2株指示菌的菌落边缘切取菌丝块制成菌饼分别接种到42个察式培养基平板中央，每株腐败菌接种21个平板，其中一个作为对照组，然后将20株内生真菌打孔制成菌饼，分别接种到腐败菌的四周，以腐败菌为圆心，2.5cm为半径的四个垂直点上，贴标签做标记，于26恒温培养3天。

三天以后，观察腐败菌与内生真菌之间是否有抑菌圈，并测出菌落的直径。

抑菌率二(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径并记录数据

其中，抑菌率大的就是初筛出的防腐剂产生菌得出2株可以产生防腐剂的内生真菌

2.2.5天然防腐剂产生菌的复筛

使用生长速率法筛选天然防腐剂产生菌

取出察式液体培养基，分别倒入2个50ml的三角瓶中，每瓶50ml，在超净操作台上，使用接种环分别将已经筛选出的20株内生真菌接种到2个三角瓶中，于26°C、130r/min摇床震荡培养7天。

内生真菌发酵液的处理

50ml发酵液经等体积的乙酸乙酯萃取三次以后，减压浓缩的浸膏用1ml的丙酮溶解，制成2种内生真菌的药液。

生长速率法筛选

在超净台上，分别将2种内生真菌的药液与融化的PDA培养基(40?50C)按照1:9的比例混合，即用1ml药液与9ml融化的培养基混合后倒入平板，每种药液倒4个平板，待培养基冷凝。设立对照组，用1ml无菌水与9ml融化的培养基混合倒入4个平板，待培养基冷凝。

在超净台上，分别用5mm的打孔器在4株培养好的腐败菌的菌落边缘打孔制备菌饼，用接种针挑取菌饼分别接种到2种药液的察式培养基平板中央，并接种到对照组上，贴标签标记后，于26C恒温箱中培养三天。

三天后，取出培养皿，采用十字交叉法测量4种腐败菌的直径。

用下列公式计算抑菌率：

抑菌率(%)=(对照净生长量-处理净生长量)/对照净生长量X100%

净生长量二菌落直径平均值-菌饼直径

记录数据

3结果与分析

3.1产天然防腐剂内生真菌的鉴定

通过上述实验，抑菌活性高的，就是可以产生防腐剂的内生真菌，进