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醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白

学号：200900140157班级：09生科3班姓名：俞华军时间：2011/03/27

一．实验目的

1.掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。

2.掌握电泳仪的使用方法。

二．实验原理

蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极定向移动，在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中想阳极移动。血清中含有书中蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH值得溶液中，所带净电荷不同，因此在电场中的移动速度不同，故可利用电泳法将它们分离。

血清中含有白蛋白、α—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同（见表一），在电场中迁移速度不同，由表一可知，血清中5中蛋白质的等电点大部分低于pH7.0，所以在缓冲液（pH8.6）中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。

表一人体血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量

蛋白质名称

等电点（pI）

相对分子质量/Mr

白蛋白

4.88

69000

α1—球蛋白

5.06

200000

α2—球蛋白

5.06

300000

β—球蛋白

5.12

90000—150000

γ—球蛋白

6.85—7.50

156000—300000

在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L的氢氧化钠溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。

肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使血清中蛋白含量下降，肾病时α1、α2、β—球蛋白升高，γ—球蛋白降低。肝硬化时α2、β—球蛋白降低，而α1、γ—球蛋白升高。所以，可以测定人体血清中蛋白含量的值来诊断一些疾病。

三．实验器材

试剂：巴比妥—巴比妥钠缓冲液、95%乙醇、无水乙醇、冰醋酸、染色液

用品：醋酸纤维薄膜（x2）、人血清、培养皿（x3）、载玻片、盖玻片、电吹风、吸管5ml（x1）、2ml（x2）、直流稳压电泳仪、电泳槽、镊子、滤纸、烧杯100ml（x2）、锥形瓶300ml（x2）

四．实验步骤

1.薄膜浸泡

选择可用的醋酸纤维薄膜（2cmx8cm）两条，浸于缓冲液中30min以上；

2.电泳仪准备

连接号电泳仪的线路，检查电路是否可用，检查完毕后往电泳槽中导入电解液，即巴比妥—巴比妥钠缓冲液；

3.点样

（1）将浸泡30min以上的醋酸纤维薄膜弄镊子轻轻取出，将薄膜一面平放在干净滤纸上，几秒后，把薄膜翻过来，把另一面平放在滤纸上，吸去多余的缓冲液，吸完后把薄膜平放于干净的玻璃上，准备点样；

（2）取几滴人血清样品于载玻片上，根据薄膜大小裁剪盖玻片大小，然后用盖玻片轻轻蘸取血清样品，然后轻轻与薄一端1.5cm处接触，待薄膜上有一条清晰的血清痕迹即可点样结束；

4.电泳

（1）用镊子夹住薄膜两端，并把薄膜拉直，轻轻放到电极桥上，点样端为阴极，并用镊子压薄膜与电极桥接触的两端，使其接触紧密；

（2）平衡10min后打开电源，调至90V，预电泳10min，随后再把电压调至110V，电泳50min—1h；

5.染色

电泳完毕后，将薄膜浸于染色液中9min—10min

6.漂洗

（1）配制漂洗液：45ml95%乙醇+5ml冰乙酸+50ml蒸馏水；

（2）把染色完后的薄膜弄镊子取出，用漂洗液漂洗至背景为灰蓝色（大概3—4次），漂洗结束后把薄膜贴于干净的玻璃上，用吹风机吹干。

7.透明和取带

（1）配制透明液：以无水乙醇：冰乙酸=7:3的比例配20ml；

（2）薄膜用吹风机吹干后，浸入透明液中，值背景为透明为止，大概10min左右，取出薄膜并贴于干净玻璃上，用吹风机吹干后轻轻从薄膜上揭下蛋白质带。

五．实验结果记录与处理

六．实验分析

1.薄膜浸泡必须30min以上，否则会影响电泳效果，取出薄膜吸取过多的缓冲液时，要注意不能长久放置于滤纸上，这样会使渗透于薄膜内的缓冲液被吸出来，使电泳时蛋白质不能完全分开，影响最后结果，而本次实验中，蛋白质区带区分并不明显，可能与此有关。

2.连接电泳仪线路时要注意正负极，用前检查电泳仪是否可用，在打开电源之前一定要把电压旋钮调至零，否则一打开电源，瞬间电压过高会烧坏仪器。

3.在往电解槽中加入电极液时要注意电极液高度不能超过红色划线，且电极槽液面要保持一致，同时要漫过电桥，否则无法形成回路，不能进行电泳。

4.点样时要注意只需轻轻的点一下即可，有一条清晰的血清痕迹即可，且要注意不要距端口太近，而如果重复点样，重复点样会导致电泳结果不清晰，条带混杂，本