DNA的溶解温度分析.docxVIP

DNA的溶解温度

我们体内的DNA是一个双链的α型螺旋，而RNA由于部分内部碱基配对而显示出独特的二级结构。在这些分子构象下，DNA或靶点RNA不能与探针（或引物）杂交。只有当探针和靶点分子处于单股的「开放线圈」构象时，杂交才有可能（见图1）。

重新变性和变性条件下dsDNA的变性和重新变性。dsDNA的构型在很大程度上取决于化学和物理因素

（a）高温、极端的pH值、变性物质（如甲酰胺）和低浓度的盐会破坏Watson-Crick碱基配对，导致单链分子处于开放线圈结构（ID）。在适当的条件下，原始形式的再熟化是可能的；然而，在复杂的、高分子量的DNA中，这个过程最初会运行得很慢。当开环结构在冰上被冷却时，两条链都不会再变性。在一定条件下，将形成一个具有内部碱基配对的紧凑线圈（IA），或者分子将保持在开放线圈配置（IB）。对核酸构型的操作是杂交和PCR测定的基本原则。

（b）用荧光染料（如EvaGreen?）观察dsDNA的变性情况。从65℃到95℃小幅度升温，使两条DNA链之间的碱基配对逐渐解开；富含AT的区域最不稳定，首先成为单链。相应地，荧光染料也会丢失。超过一定的温度，取决于碱基的组成和DNA的大小，所有的荧光色素将回到溶液中，荧光将变得最小。当使用荧光数据和温度时，熔融曲线可以直观地显示这一过程。当50%的碱基被解离时，荧光的损失是最迅速的。这个点要用数学方法计算，叫做Tm。