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免疫组织化

免疫组织化学

免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

发展简史

——1941年Coons首先用荧光素标记抗体一检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。

——60年代Nakane建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。

——70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。

——80年代Hsu等建立了抗生物素一生素（ABC）法之后，免疫金一银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。

——90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。

——2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。

免疫组织化学的技术分类

（1） 根据染色方式分成：①贴片染色；②漂浮染色。

（2） 根据Ag—Ab结合方式分成：①直接法；②间接法；③多层法。

（3） 按标记物的性质分成：

免疫荧光技术（免疫荧光法）；

免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）；

免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）。

3.标记物

（1） 必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。

（2） 常用标记物

荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC） 荧光

显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（rho—damineRB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光；

酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。

生物素：（Biotin）

铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。

其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）

4.应用

凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。

一、免疫组织化学技术

（一）染色方法

直接法

荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察一检测抗原。

△酶标抗体要显示后镜检。

直接法优点：简单，时间短，特异性强。

缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。

应用：基本不用了！！

间接法

荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的IgG抗体）。

显色后镜检

特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体一鉴定多种抗原。

非标记Ab桥法：

“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。

（1）单桥法

（2）双桥法

在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。

特别提示：注意动物种属关系

PAP法（过氧化物酶一抗过氧化物酶法

Peroxidaseanti—peroxidasemethod,PAP法）~是桥法的改良，既先形成PAP复合物一抗原一抗体一抗IgG抗体—PAP复合物。

该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。

5.ABC法（亲和素一生物素一过氧化物酶复合物法，Avidin—biotin—peroxidase

Complexmethod，ABC法）

Avidin：亲和素，一种糖蛋白，其上有4个与生物素相结合的位点。

Biotin:生物素一维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。

ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。

（1）ABC复合物的制备：

（2）ABC法反应原理

SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）Streptavidin/peroxidaseorstrepta-vidin/alkalinephosphatase）

该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO。它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，背景低，成本低。

现在还有plus盒。优点是：更简便，放大倍数f，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力f，原理保密。

蛋白A—金法（Protein—Agoldmethod）

多用于电镜

双重组化染色法

应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。

免疫金一银染色法（Immunogold—silverstainingIGSS）

（二） 固定

注意事项：

固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和性