DB63T 863-2009实验室冬虫夏草真菌 中国被毛孢真菌保存技术规程.docxVIP

ICS

备案号：26842-2010

青海

DB63

省地方标准

DB63/T863—2009

实验室冬虫夏草真菌--中国被毛孢真菌保存技术规程

2009-12-07发布

2010-01-10实施

青海省质量技术监督局发布

I

DB63/T863—2009

目次

前言 II

1范围 1

2术语 1

3菌种制备 1

3.2菌种纯化方法 2

4菌种保存方法 2

4.5冬虫夏草真菌的保存步骤 2

6保存菌种的复壮 3

II

DB63/T863—2009

前言

本规程由青海省畜牧兽医科学院提出并归口。

本规程由青海省畜牧兽医科学院草原所负责起草。

本规程起草人:李玉玲、马少丽、刘欣、徐海峰、张宗豪。

本规程由青海省质量技术监督局批准发布。

1

DB63/T863—2009

实验室冬虫夏草真菌--中国被毛孢

1范围

本规程规定了冬虫夏草真菌分离培养后的保存技术措施。

本规程适用于冬虫夏草真菌——中国被毛孢分离培养后的保存。

2术语

2.1

中国被毛孢(HirsutellasinensisLiu,Guo,YuZeng)

指冬虫夏草的无性型。

2.2

菌种

冬虫夏草体内分离出中国被毛孢。

2.3

无菌操作

指采用经过一定消毒措施处理之后的环境、器具及人为操作的工作方式。

2.4

培养基

是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。

2.5

菌种纯化

有一种以上的微生物培养物称为混和培养物。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞,那么这个菌落称为纯培养，这个过程就是菌种纯化。

2.6

菌种衰退

菌种在培养或保藏过程中,由于自发突变的存在,出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象。

2.7

菌种保藏

就是对活体微生物群体进行有效的保藏的生物学方法。

2.8

水活度(Aw)

是影响干燥菌种保藏稳定性的重要因素。

3菌种制备

3.1菌种纯化

3.1.1纯化菌种用培养基配方

3.1.1.1牛肉汤的制备

2

DB63/T863—2009

3.1.1.1.1先将新鲜牛肉去除筋和脂肪，然后取1kg牛肉加蒸馏水2kg放入容器内煮沸，煮沸约40分钟后将肉渣滤去，肉水经121℃、0.1MPa高压灭菌30min后备用。

3.1.1.1.2注意：①煮沸时应边煮边搅动；②煮沸前应在容器壁上划一刻度，煮沸时随时添补蒸馏水。

3.1.1.1.3固体培养基(1000ml)：牛肉汤500ml、牛奶200ml、葡萄糖30g、琼脂18g、水解乳蛋白5g、酵母浸膏1g、磷酸氢二钾1g、核糖核酸0.5g、硫酸镁0.2g，加水定容至1000ml。

3.1.1.2液体培养基：液体培养基配方不加琼脂外，按照本标准3.1.1.1.3固体培养基制备方法进行制备。

3.1.2培养基的制备

3.1.2.1固体培养基：按照本标准3.1.1.1.3中的配方，依次加入水解乳蛋、酵母、葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、核糖核酸和琼脂放入容器内加热煮沸溶化后备用；量取牛奶200ml加热煮沸后取下备用；将上述溶液和牛肉汤共同放入容器中加水定容至1000ml，煮沸后，用1N的盐酸或1N氢氧化钠调制PH6.7，分装于试管内(中试管每支6ml~7ml)，115℃、0.075MPa灭菌30min后取出摆成斜面备用。

3.1.2.2液体培养基：将上述溶液除去琼脂不加，和牛肉汤共同放入容器中煮沸后，用1N的盐酸或1N氢氧化钠调制PH6.7，分装于250ml三角瓶内(每瓶装150ml)，115℃、0.075MPa灭菌30min后备用。

3.1.3菌种纯化方法

将实验室分离培养得到的冬虫夏草真菌，经显微镜检查确认为中国被毛孢后，将该菌落边缘挑取少量菌丝体，接种在纯化用固体培养基上，10℃~15℃条件下培养。待菌丝长满斜面后，再接种到纯化用液体培养基中，在10℃~15℃、120r/min条件下，每天10小时连续进行震荡培养，待震荡培养至液体中长出菌丝球后，再次转接到固体培养基中。反复移植2次~3次，即达到菌种纯化。

4菌种保存方法

4.1试管继代保存法(斜面低温保藏法)

4.1.1将长满菌丝的斜面培养基，置4℃~6℃下保存，保持温度稳定，每5个月~6个月传代一次。此方法最多只能传代3次~4次，4代后就失去了活力