双酶切实验 - 中学实验.docxVIP

也可离心后余100μl几个非常重要的问题1做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为

也可离心后余100μl几个非常重要的问题1做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LI

、全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。b、42℃加热90秒钟后

缓冲液相应盐浓度下的作用活性。双酶切建议缓冲液注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系

中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性

双酶切反应(DoubleDigests)

1、同步双酶切

同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。

2、分步酶切

如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。

3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图）

使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。

双酶切建议缓冲液

注：

只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。

注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。

某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“se

q”标注。

[编辑本段]

双酶切的注意事项

1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。

2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。

3、对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照：

酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两

管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。

[编辑本段]

双酶切连接反应之全攻略

1、回收PCR产物：

也可离心后余100μl几个非常重要的问题1做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LI的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测在进行PCR

也可离心后余100μl几个非常重要的问题1做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LI

的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产

1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，

粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒

酶量的问题：以TAKARA的