双酶切连接反应 - 生物学.docxVIP

的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,

的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近

加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120秒(根

位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某

性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用

1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFE的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKAR纯化柱试剂盒

酶量的问题：以TAKAR为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接

摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（Xpmoles×长度bp×650）/1,000,000（注：长度bp

×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,

如载体是5380bp，则0.03pmol为

0.03×5.38×0.66=0.106524μg。

测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARK行估测，如MARKER200，05微升的MARKE个条带约50ng。

连接反应：TAKAR连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20μ的l连接反应体系中，6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350U/μl，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。

3、转化：

a、全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

c、加入890μlAMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。

取100μ铺l板。也可离心后余100μl

几个非常重要的问题

1做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.

2对含有AMP-RESISTENE质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌

握温度。铺板前后注意用吹风机吹干

3对照的设立：

为验证双酶切是否成功,可做如下对照:

A酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER跑,胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.

做转化时,也要进行对照.

设4个:

A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都

反应,置于冰箱中保存