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土壤总DNA的几种提取方法

SDS高盐法（方案1）

具体步骤：

称取1g土壤，放入研钵中，倒入适量的液氮，立即研磨;再倒入适量的液氮，研磨，重复3次，使土壤颗粒研成粉末；

将13.5ml提取缓冲液（0?1mol/L磷酸盐[pH=8.0],0.1mol/LEDTA[pH8.0],0.1mol/LTris-HCl[pH8.0],1.5mol/LNaCl,1.0%CTAB和50pl蛋白酶K（10g/L）与5g土壤置于50ml的离心管中，放入37°C恒温摇床上,225r-min-1振荡30min;

加入1.5ml20%SDS,轻轻混匀,65C水浴加热2h,每隔15?30min轻轻摇匀1次;5000rmin-1离心10min将上清液转入新的50ml离心管中;取4.5ml提取缓冲液加入原离心管，摇匀泥浆,加入0?5ml20%SDS,65C水浴15min用上述同样的离心速度离心10min，将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1次；

用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000r-min-1离心20min散集上清液，并加入0.6倍体积的异丙醇，室温静置1h;25C下12000rmin-1离心20min,倒出上清液，干燥后加入500pl去离子水，溶解粘附于离心管壁的DNA及其杂质，并收集于1.5ml的微型离心管中?

变性剂加SDS高盐法（方案2）

具体步骤：

取1g土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1ml变性剂（4mol/L异硫青酸胍,10mmol/LTris-HCl[pH7.0],1mmol/LEDTA[pH8.0],0.5%2巯基乙醇）；液氮冰冻，研磨至溶解，重复3次；

转入50ml离心管中,加入9ml提取缓冲液（0?1mol/L磷酸钠[pH7.0],Tris-HCl[pH7.0],0.1mol/LEDTA[pH8.0],1.5mol/LNaCl,1%CTAB,2%SDS）;65C水浴1h,每10min轻轻混匀1次;5000r-min-1离心10min，取上清；

在原管中加入5ml提取缓冲液,混合后,65力水浴10min，离心，取上清,合入上述上清液；重复一次;加入等体积的氯仿混合,5000r-min-1离心20min,取上清;加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀1h;20?25C,12000r-min-1离心20min,TE溶解沉淀?

SDS-酚氯仿抽提法（方案3）

称取1g土壤样品，加入1ml0.1mol/lPH8.0磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min,加125ul20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置顼,离心，70%乙醇清洗，200UlTE溶解。

冻融溶菌酶SDS裂解法(方案4)

取1g土壤样品，加如0?5ml灭菌的抽提缓冲液(100mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,200mmol/LNaCl,1.0%PVP,2.0%CTAB,PH8.0),力口玻

璃珠旋涡5~10min，在液氮中冷却1min后迅速在沸水中煮2min，如此重复3次，13000r/min离心10min。上清夜快速置于冰上备用，沉淀用于进一步裂解。将上述沉淀悬浮于0.2ml提取缓冲液中，旋涡10min，加入溶菌酶（100ml/l）50ul,轻轻混匀后，37C温浴30min，再加入250ulSDS缓冲液（100mmol/lTris-HCl,200mmol/lNaCl,2.0%SDS,PH8.O,上下颠倒10min，13000r/min离心10min,收集上清夜。

二、 DNA纯化

葡聚糖-200凝胶G离心层析纯化

取2ml灭过菌的一次性塑料注射器，用注射器推杆将灭过菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度约为0.5cm，然后向注射器筒中加入TE缓冲液浸透的葡聚糖凝胶G-200，制成简式离心层析柱，再置于10ml的离心管中，于高速冷冻离心机上以3000r/min离心20min，去除葡聚糖凝胶G-200中的TE缓冲液，将离心层析柱再置于另一10ml的离心管中，在离心层析柱顶部加入50ul粗土壤DNA，以10min为周期于3000r/