松材线虫分子检测（RPA法）技术规程（征求意见稿）.docx

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T/JSFXXXX-2XXX

松材线虫分子检测（RPA法）技术规程

1范围

本标准规定了松材线虫分子检测RPA法技术规程的术语和定义、检测对象、检测流程、结果判定以及记录和归档。

本标准适用于进出境植物检疫，国内植物检疫以及林业有害生物调查中松材线虫及其寄主植物和制品携带松材线虫的分子检测鉴定工作。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。

GB/T35342-2017松材线虫分子检测鉴定技术规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准

3.1松材线虫pinewoodnematode[Bursaphelenchusxylophilus(SteineretBuhrer)Nickle]

一种无脊椎动物，属于线虫门(Nematoda),侧尾腺纲(Secernentea),滑刃目(Aphelenchida)、滑刃总科(Aphelenchoidoidea)、滑刃科(Aphelenchoididae),伞滑刃亚科(Bursaphelenchinae),伞滑刃属(Bursaphelenchus)的植物寄生线虫。

3.2松材线虫病pinewiltdiseasecausedbypinewoodnematode

又名松树萎蔫病，是由松材线虫寄生在松树体内所引起的一种松树毁灭性森林病害。

3.3寄主植物及其制品pinewoodandwoodproducts

松材线虫寄主植物及其原木，锯材和用于承载、包装、铺垫，支撑、加固货物的木质材料，如木板箱、木条箱，木托盘、木框、木桶、木轴、木楔、垫木、枕木和衬木等。经人工合成或经加热、加压等深度加工的包装木质材料，如胶合板、纤维板等除外。

3.4分子检测moleculardetection

以功能基因、核糖体、ITS等区域为靶标，采用分子生物学的方法在基因水平上对物种进行鉴定。

3.5引物primer

一段短核苷酸序列。其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，在聚合反应时，引导合成一条与模板互补的DNA的序列。

3.6阳性对照positivecontrol

试验的一个控制处理，用于检验试验木身的正确与否。即在用分子生物学技术手段对物种进行检测鉴定时，一个试验处理的模板为该物种的DNA。

3.7阴性对照negativecontrol

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T/JSFXXXX-2XXX

试验的一个控制处理，用于检验试验本身的正确与否。即在用分子生物学技术手段对物种进行检测鉴定时，一个试验处理的模板用无菌水替代。

4检测鉴定对象

疑似松材线虫，或疑似带有松材线虫及其传播媒介昆虫活体的寄主植物(参见GB/T35342-2017附录A)及其制品。

5检测原理

重组酶介导等温扩增RecombinasePolymeraseAmlification,RPA

RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在39℃左右。

重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成扩增，对模板上的目标区域在等温39℃左右条件下进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。依赖核酸内切酶IV（nfo酶）的作用，加入根据模板设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。也可结合荧光检测设备检测扩增过程中的荧光信号，通过检测系统配置的软件进行最终结果的判读。

6检测所用仪器设备

荧光检测仪、金属浴、离心机等。

7检测流程

7.1样品DNA的提取

7.1.1木屑中线虫DNA的提取

在寄主植物或其制品上用6.5mm的钻头钻取木屑1g～2g，加入2mL离心管中，再加入1.6mL裂解A液，5μLB液浸没木屑，放入设好程序的金属浴中，先在65℃下加热25分钟，再95℃下加热5分钟。12000r/min离心3分钟，上清液既是提取好的DNA扩增模板。

[来源：GB/T35342-2017，附件C，有修改]

7.1.2线虫液DNA的提取

在20μL线虫液中加入20μL裂解A液，2μL裂解B液，放入设好程序的金属浴中，先在65℃下加热5分钟，再95℃下加热5分钟。12000r/min