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p53基因克隆表达及其活性测定的综述报告

概述

p53基因是人体中最为重要的肿瘤抑制基因之一，其主要作用是监视细胞DNA损伤并协同其他细胞因子促进细胞修复或导致细胞凋亡。p53基因的突变与肿瘤的发生密切相关，因此p53基因的克隆和表达及其活性测定具有非常重要的生物学意义和临床应用价值。本文将对p53基因克隆表达及其活性测定方面的内容进行综述，并阐述其在研究和诊断肿瘤等方面的应用。

p53基因的克隆与表达

p53基因是一个非常长的基因，包括了11个外显子和10个内含子，其编码一个分子量为53kDa的蛋白质。国外学者刘家骏等通过PCR扩增技术，从人类DNA中首次成功克隆了p53基因。目前在临床上应用较为广泛的p53基因重组表达载体是pCMV-p53，该载体是以真核表达质粒pCMV为基础，将人p53基因全长克隆插入pCMV的多克隆位点MCS中，构建而成。

基于目前p53基因的克隆和表达技术，可以通过以下步骤来进行p53基因的克隆和表达：

（1）选择p53基因的模板DNA，例如人外周血或小肠上皮细胞中的基因组DNA，质粒DNA等；

（2）设计引物并PCR扩增p53基因；

（3）纯化PCR产物，克隆p53基因至pCMV载体中；

（4）测定克隆体的长度和正确性，并鉴定是否含有p53基因；

（5）将pCMV-p53转染进入目标细胞中，表达蛋白质。

p53基因的活性测定

p53基因蛋白质的功能主要由其转录激活和转录抑制两种方式实现，p53蛋白质对上述两种转录调节过程的影响，主要是通过与其他蛋白质进行物理互作实现的。因此，传统的西方印迹和免疫印迹等方法可以用于p53蛋白质的检测。

另外，细胞系培养的方法被广泛应用于p53技术研究中。例如，通过向黑色素瘤细胞株ATCCHTB-71中转染p53基因，可以使该细胞株重新恢复对DNA损害或应用化学药物的敏感性，从而实现对p53基因活性的研究。

在p53基因活性测定中，还有一种比较重要的技术是荧光素酶报告系统（LuciferaseReporterAssay）。该技术可以通过在启动子区域中添加荧光素酶基因来检测p53活性的变化，通过荧光素酶酶活性的检测，可以监测到p53基因所调控的同源启动子的转录水平和活性。

p53基因在肿瘤诊断中的应用

p53基因与肿瘤的发生和发展密切相关。早期的研究表明，p53基因突变或缺陷会导致p53蛋白质功能的丧失，从而失去对DNA损伤的修复和细胞凋亡的诱导作用。基于这一认识，p53基因的检测在肿瘤诊断和治疗中逐渐变得重要。

临床上可以通过以下技术进行p53基因检测：

（1）免疫组织化学染色：p53蛋白质扮演了细胞核中的调节者角色，因此，通过免疫组织化学染色对p53蛋白质的表达进行定性和定量分析，可以帮助我们确定肿瘤的类型和级别；

（2）Sanger测序：通过PCR扩增p53基因并应用Sanger测序技术，可以检测p53基因序列中的单核苷酸多态性和突变等变异信息，同时还可以判断突变对p53基因蛋白质功能的影响；

（3）荧光原位杂交技术：通过对肿瘤样本中p53基因的荧光原位杂交技术进行分析，可以帮助我们对p53基因的数量和突变状态进行更加准确的鉴定，从而提高肿瘤的诊断和治疗的精确度和准确性。

结论

p53基因的克隆表达技术和活性测定技术是肿瘤生物学研究中非常重要的组成部分，可帮助我们更好地理解p53基因的生物学功能和与肿瘤发生发展的关系。此外，在肿瘤的诊断和治疗中，p53基因的检测也具有非常重要的临床应用价值。随着科技的不断发展与进步，p53基因的应用前景也将更加广阔。