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猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

姜雪;高玉伟;胡桂学;杨松涛;赵明媚;刘秋燕;徐春忠;梁秀娟;夏咸柱

【摘要】依据GenBank中编码猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白ORF2的保守序列,设计

并合成了一对引物和相应的TaqMan探针,建立了快速检测FCV的荧光定量PCR

方法.通过对该方法的反响体系和反响条件进展优化,建立了标准曲线,给出了特异性、

敏感性和重复性试验,并对临床24份疑似样品(其中阳性3份、阴性21份)进展检

测.结果说明:该方法检测cDNA的线性关系为0.992,线性范围为2.26×1011～

2.26×101拷贝/μL;可检测出样品中的FCV,其他猫相关病毒检测为阴性;批内重复

性试验变异系数为2.158％,与病毒分别结果相符.

【期刊名称】《吉林大学学报〔理学版〕》

【年(卷),期】2023(051)005

【总页数】5页(P973-977)

【关键词】猫杯状病毒(FCV);荧光定量PCR;检测方法

【作者】姜雪;高玉伟;胡桂学;杨松涛;赵明媚;刘秋燕;徐春忠;梁秀娟;夏咸柱

【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院,长春130118;军事医学科学院军事

兽医争论所,长春130062;吉林农业大学动物科学技术学院,长春130118;军事医学

科学院军事兽医争论所,长春130062;吉林农业大学动物科学技术学院,长春

130118;吉林农业大学动物科学技术学院,长春130118;上海野生动物园,上海

202300;吉林省野生动物抢救繁育中心,长春130122;军事医学科学院军事兽医争

论所,长春130062

【正文语种】中文

【中图分类】Q95

猫杯状病毒(felinecalicivirus,FCV)为单股正链RNA,无囊膜,直径30～40nm[1],

是一种猫和局部猫科动物普遍存在的病原体.易感动物感染FCV后表现为口腔溃疡、

上呼吸道感染、慢性口炎、鼻炎、结膜炎、肺炎或跛行等临床病症[2-3]，其临床

病症的多样性取决于FCV基因的多样性[4],与由猫疱疹病毒(FHV)引起的猫传染性

鼻炎相像,二者也常混合感染[5].高致病性FCV可引起动物全身性感染,甚至死亡.感

染FCV的猫一局部恢复安康,另一局部成为无病症的病原携带者[6].检测FCV的方

法有病毒分别鉴定和血清学试验,对分别的病毒可通过电镜检查、RT-PCR、荧光定

量PCR鉴定或与抗血清做中和、琼扩、免疫荧光或补结试验进展鉴定[1].其中荧光

定量PCR方法应用广泛[7-12],如Sykes等[13-14]建立了对FCV检测的一般PCR

方法;Helps等[15]用染料法建立了FCV荧光定量PCR检测方法;Wilhelm等[16]

以FCV的ORF2为目的基因建立了荧光定量PCR方法检测FCV,最低检测范围为

(5×101～5×102)拷贝/μL.本文通过优化FCV荧光定量PCR条件,为临床样品的检

测供给准确而快速的检测方法.

1材料与方法

1.1毒株和细胞

FCV由军事兽医争论所于2023年分别自国内某患病死亡的虎；猫鼻气管炎病毒

(FRtV)、猫泛白细胞削减症病毒(FPV)和猫肾细胞(F81)均为吉林农业大学动物科学

技术学院试验室保存.

1.2主要仪器和试剂

德国Tiangen公司生产的AgilentMx3000P型实时荧光定量PCR仪;美国ABI公

司生产的PCR仪;德国Bio-LmagingSystems公司生产的凝胶成像系统;美国

Qnawell公司生产的核酸蛋白.

质粒小提试剂盒(D100)和琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒(D100)购自北京索莱宝科

技;反转录试剂盒(AT301)和pEASY-Blunt载体(CB101-01)购自全式金生物技术

;TRIZOL试剂(D9108A)、Pfu酶(D7336)、大肠杆菌感受态DH5α(D9057)、DL

2023DNAMarker(D501S)和荧光定量PCR试剂盒(DRR390)等均购自大连宝生

物工程.

1.3引物设计与合成

依据GenBank中编码FCV衣壳蛋白ORF2的保守区基因序列,利用Primer5.0软

件,设计并合成一对特异性引物及探针.上游引物：5′-

CTGACTTCAAATTTCATCTC-3′;下游引物：5′-T