基因分离与克隆.pptVIP

⑴核酸杂交法:以特殊标记的寡核苷酸链为探针将扩增好的cDNA文库（即许多带有cDNA重组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）4.筛选目的基因第63页，课件共99页，创作于2023年2月第64页，课件共99页，创作于2023年2月⑵免疫结合法噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢固地结合在膜上。然后将膜放入含有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去未结合的抗体后，再与125I标记的第二抗体结合,从而找出带有放射性示踪信号的斑点,进而找出对应噬菌斑,克隆扩增,提取DNA后经酶切可获目的基因。第65页，课件共99页，创作于2023年2月基因组文库cDNA文库信息供体DNAmRNA载体噬菌体，黏粒，人工染色体质粒，噬菌体连接前部分酶切，分级分离反转录合成cDNA双链连接粘端连接，人工接头同聚物加尾，人工接头筛选核酸探针核酸探针，免疫探针基因组文库和cDNA文库的比较第66页，课件共99页，创作于2023年2月组织可克隆之DNA载体DNAcDNAmRNA部分酶解DNADNA长度分级双链cDNADNA与载体连接引入宿主细胞鉴定文库的完备性扩增后供长期储存筛选出所需要的克隆第67页，课件共99页，创作于2023年2月应用差别杂交法构建cDNA文库适用于分离经特殊处理而被诱发表达的cDNA克隆；技术基础：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达；可以通过这两种总mRNA（cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对有目的基因表达的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。四、获得目的基因的其他方法第68页，课件共99页，创作于2023年2月差示筛选（DifferentialScreening）第69页，课件共99页，创作于2023年2月构建差示文库筛选特殊基因。差示文库（differentiallibrary）又称扣除文库（subtractedlibrary）,是反映不同组织细胞或同一种细胞在不同生理状态下,基因表达差异的cDNA文库。2.应用扣除杂交法构建cDNA文库第70页，课件共99页，创作于2023年2月不是细胞内所有表达基因全体的集合，而是主要含差异表达基因的部分cDNA的集合；用过量的参照细胞mRNA或cDNA与目的细胞cDNA或mRNA(又称目的序列)杂交，形成的RNA-cDNA杂交体是两种细胞共有的，将其扣除；剩下的cDNA或mRNA可以标记成探针(称减法或扣除探针)，从上述目的细胞的cDNA文库中筛选目的克隆；实质上是除去了一大批高丰度非特异性的cDNA，含有的是特异表达的cDNA克隆及其它一些低丰度mRNA的cDNA克隆。第71页，课件共99页，创作于2023年2月扣除杂交（SubtractiveHybridization）第72页，课件共99页，创作于2023年2月若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。载体种类装载量转染率λ噬菌体粘性质粒(Cosmid)酵母人工染色体(YAC)9～22kb30～45kb100～1000kb105～106转化子／μgDNA104～106转化子／μgDNA～500转化子／μgDNA表4-1三种常用基因组文库克隆载体的比较第31页，课件共99页，创作于2023年2月（5）基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大：以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的