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免疫毒性试验技术指导原则

（征求意见稿）

中国食品药品检定研究院

2023年9月

如果免疫表型分析显示自然杀伤（NK）细胞数量发生变化，或常规毒性试验发现病毒感染率升高，或基于其它一些原因，可进行NK细胞活性试验。通常，NK细胞试验采用已经给予受试物的动物组织（如脾脏）或血样进行离体试验。主要采用微量培养法和乳酸脱氢酶（LDH）释放法，其原理是观察NK细胞对敏感的肿瘤细胞的溶解作用，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放至细胞外。也可采用流式细胞法，通过检测标记的靶细胞凋亡比例，即可反映出NK细胞的活性。

四、免疫毒性评价要点

（一）免疫抑制

免疫抑制即免疫系统的广泛抑制，可致机体的易感性增加和肿瘤性疾病的风险增加。当受试物的潜在免疫抑制作用在已有常规毒性研究中不能明确免疫系统受影响的特定部分/功能时，应考虑进行免疫毒性研究以评估对免疫系统的影响。免疫抑制的检测采用多层级方式，第一层级免疫抑制试验为初始筛选阶段，主要由非功能性试验组成，增加血液淋巴细胞亚群分布及NK细胞活性等功能试验可增加筛选阶段的预测性；第二层级试验主要是功能性试验。特异性和敏感性随层级逐级增加。第一层级中产生的免疫抑制指征有免疫器官重量、细胞数目、细胞群以及免疫球蛋白的变化；第二层级中可采用特异性的免疫功能检测，如评价免疫期间对体液免疫功能的影响，可采用ELISA等方法检测特异性抗体、采用PFC试验检测特异性抗体生成细胞的数量；评价对特异性细胞免疫反应的影响，可采用淋巴细胞增殖试验等；评价NK细胞活性可采用微量培养法或LDH释放法等。

单一的毒性或免疫抑制研究不能用于评价全部的免疫相关参数，有必要识别最重要的指示参数并选择合适的方法来评定受试物的免疫抑制。免疫抑制试验最好结合全身毒性试验，因为全身毒性试验采用系列剂量的受试物对全身主要器官系统的反应进行评价。常规毒性试验可参照（三）中“常规毒性研究”的免疫毒理学参数进行免疫毒性的测定。如常规毒性试验中观察到的反应可以直接预测其在人体的反应时，则不需要附加的免疫毒性研究。

（二）免疫刺激

免疫刺激是指具有增强免疫系统活性的物质通过直接刺激免疫相关信号通路或通过抑制/激活免疫相关调节因子等间接作用激发免疫系统活性，从而引起的一种免疫毒性的类型。在大多数情况下，免疫刺激不会导致对传染性疾病抵抗力的降低，但可能会增加过敏性和自身免疫性疾病的风险。

用于免疫抑制的试验方法也适用于免疫刺激的检测。那些可以非特异性刺激免疫系统的物质，最好采用已诱导致敏或自身免疫的动物模型进行评价研究。目前还没有建立能够将动物数据外推至人的用于检验过敏症和自身免疫的有效动物模型。当在实验动物上无法充分暴露免疫毒性风险时，

应采用离体组织或系统，如人源免疫细胞，开展相关免疫毒性试验。

除了化妆品原料本身的免疫刺激性，还应考虑污染物或残留物的免疫刺激活性。

（三）超敏反应

作用物具有抗原特性被免疫系统识别，同样地，也可以作为变应原诱发超敏反应。最常见的超敏反应类型有速发型超敏反应（I型）和迟发型超敏反应（IV型）。I型超敏反应由IgE介导，可以通过检测特异性IgE的产生，对于I型超敏反应尚没有好的预测性试验，最经典的诱发方法包括被动过敏反应检查法。IV型超敏反应包括抗原特异性细胞炎症反应，可参考《化妆品安全技术规范》中“皮肤变态反应试验”方法，如Buehler试验（BT）等。

自身免疫性疾病在很大程度上是由遗传性因素引起的,经确认至少有4种机制可诱导自身免疫性疾病，即正常细胞内的物质如释放进入循环被识别为异物（隐蔽抗原）、由于化学、物理或生物学改变可转变为免疫原性的（自身抗原）、可诱导免疫应答，与正常自身抗原交叉反应（异物抗原）、发生在免疫功能细胞内的突变等。因此常规毒性试验不太可能检测出自身免疫的诱发潜能。目前提出的自身免疫预测性试验模型主要是胭窝淋巴结试验的改良方法，该试验中引流淋巴结的增殖反应被认为是致敏反应诱发的指示，包括自身免疫。

（五）炎症反应

免疫毒性物质能与免疫系统的非特异性成分（即粒细胞、巨噬细胞和其他能产生和释放炎症介质的细胞类型）相互作用。局部炎症反应是很常见的，评价炎症反应程度最直接的方法就是对炎症部位进行病理学观察。

五、结果分析及评价

免疫系统的应答是一个十分复杂的过程，因此，观察化妆品原料对机体可能存在的免疫毒性作用的研究应该考虑全面、深入，不能以少数实验结果来评价其免疫毒性作用，应根据化妆品的暴露途径、免疫应答的特点，结合动物的生理特性并选择合适的动物进行，对免疫毒性的试验数据进行分析时，应该对全部数据进行综合评价，以便有充分的数据对免疫毒性风险进行合理的评估。根据所观察到的各种免疫毒