BCA法测定蛋白质含量.ppt

Lambert－Beer定律A=KCL定义：一束单色光通过介质溶液后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。1、只适用于单色光；λmax2、仅适用于稀释溶液；3、对于混合稀释溶液，应该尽量去除干扰物质；（空白管）4、A值控制在0.2～0.8之间。（A：吸光度；K：吸光系数；C：吸光物质的浓度；L：吸收层厚度）思考：根据该定律，如何计算待测物的浓度？Lambert－Beer定律的应用1.利用标准管计算测定管浓度(标准管法)用一已知浓度的测定物(标准管)按测定管同样处理显色，读取吸光度，再根据A=KCL计算。同一台仪器比色皿内径相同（L标=L测）,标准管和测定管为同一物质,吸光系数相同（K标=K测），A测=K测×C测×L测A标=K标×C标×L标C测=A测/A标×C标配制一系列的标准管，然后绘出标准曲线。再测出测定管的吸光度，在标准曲线上查找到对应浓度。浓度（C）时间:仪器型号:仪器编号:作图者:A2.利用标准曲线法进行换算测定物浓度（标准曲线法）思考：试比较两种方法优缺点。A待测C待测预热打开电源开关，打开样品室，使仪器预热20分钟。调波长转动波长手轮，调至所需要的单色波长。调节T=0%?调节功能键到“T”档，空白溶液、待测溶液依次放入样品室，使空白溶液对准光路，按下“0%”键，使数字显示为“0.000”。（此时样品室必须是打开的）调节T=100%把样品室盖子轻轻盖上，按“100%”键，使数字显示正好为“100.0”。调节A=0将功能键调节至“A”档,此时数字显示为“.000”。如果不是，则按T100（即A0键）6.吸光度测定拉动拉杆使待测液依次进入光路，读取A值。7.关机冲洗比色皿，关电源。使用步骤打开样品室盖，切断光路蛋白质定量BCA法什么是蛋白质？其元素组成？基本组成单位？分子结构？结构与功能的关系？理化性质？如何分离纯化？定性？定量？BCA法是根据蛋白质什么性质？是什么或者有什么？有多少？为什么蛋白质可以定量测定？基于什么原理？呈色反应A=KCL，标准管法或者标准曲线法计算一.实验目的1、掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理及操作；2、掌握722型分光光度计、移液管的正确使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法计算蛋白质的浓度；3、了解蛋白质含量测定的多种方法。二.实验原理BCA分子式BCA试剂盒在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，Cu+与两分子BCA（二辛可酸）反应形成紫蓝色的络合物，测定其在562nm处的吸光度值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白质的含量。紫蓝色二.实验原理562nmA562∝M蛋白质二.实验原理采用标准曲线法计算待测液含量A待测m待测45°作图人：仪器型号：722型分光光度计时间：波长：562nmBCA法测定蛋白质含量标准曲线试剂盘摆放及移液管选择试剂盘摆放：试剂在左，移液管在右侧取试剂时，将试剂和相应的移液管拿出试剂盘，用完之后放回原处，谨防试剂污染。①②③④⑤①②③④⑤三.实验步骤取7支试管按下表编号并操作：（平行加样、准确量取）管号试剂（mL）空白管12345测定管标准蛋白溶液（0.3mg/ml）—0.10.20.30.40.5—蒸馏水3.02.92.82.72.62.52.5待测样品(小牛血清，已经稀释了500倍)——————0.5BCA工作液2.02.02.02.02.02.02.0蛋白质含量(ug)306090120150将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。三.实验步骤1、以蛋白质含量为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。2、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量m,再计算出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。注意：最后浓度单位要统一换算成g/LC=mV——×500小牛血清正常范围为：30-50g/L原始数据管号空白管12345测定管m(ug)01530456075吸光度(A)仪器名称、型号