外源基因的表达及其优化策略.pptVIP

第三节外源基因在真核细胞中的表达原核表达系统与真核表达系统的区别？1.原核表达系统的表达系统是原核细胞;真核表达系统则是在真核细胞里例如酵母细胞,昆虫细胞,哺乳动物细胞中表达。2.两种表达系统都是通过含有原核或者真核启动子以及其他其他表达相关元件的质粒系统来实现外源基因的表达。3.原核表达系统与真核表达系统相比,表达量效率便于优化调整,表达量高.但用来表达真核来源的外源基因时,由于蛋白折叠和糖链修饰不同,因此其应用受限.真核表达系统表达量相对较低,虽然酵母和昆虫系统表达量相对较高,但是在表达哺乳细胞来源基因同样存在折叠和糖链修饰的不足。第95页，课件共133页，创作于2023年2月一、真核生物基因表达与调控的特点1.基因组DNA的存在形式可影响基因表达2.转录与翻译不偶联3.调控是多层次的4.具有组织和细胞类型特异性5.对信号分子反应不同第96页，课件共133页，创作于2023年2月二、真核生物基因表达载体的组成特征第97页，课件共133页，创作于2023年2月二、真核生物基因表达载体的组成特征1.原核DNA序列2.启动子组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、杂合启动子3.增强子4.终止子5.内含子6.polyA加尾信号7.选择标记基因和报告基因第98页，课件共133页，创作于2023年2月三、真核表达的受体系统（一）酵母表达系统酵母是一类最简单的真核生物,其生长代谢与原核生物相似；但在基因表达与调控方面类似于高等生物。1、酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。第99页，课件共133页，创作于2023年2月2、酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物第100页，课件共133页，创作于2023年2月3、常用的宿主酿酒酵母宿主菌巴斯德毕赤酵母宿主菌乳酸克努维酵母宿主菌多型汉森酵母宿主菌其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多种抗体等。第101页，课件共133页，创作于2023年2月4、酵母基因表达载体酵母载体可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代DNA和RNA单位。酵母菌中的野生型质粒酵母菌克隆表达质粒的构建第102页，课件共133页，创作于2023年2月五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式2.融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，这种方式表达的蛋白.优点：稳定性加强；具有较高的水溶性和一定的生物活性；能高效表达；易于分离纯化.第63页，课件共133页，创作于2023年2月融合基因：通常是指通过自发突变事件形成的或是应用DNA重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。融合蛋白质：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。其中通常受体细菌蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。第64页，课件共133页，创作于2023年2月融合蛋白质配偶体：指融合蛋白质中与目标蛋白质连接的别种蛋白质组分。常见的配偶体：葡萄球菌蛋白质A(SPA)、链球菌蛋白质G(SPG)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和硫氧还蛋白(Trx)。第65页，课件共133页，创作于2023年2月融合蛋白表达系统的构建的三个原则：首先，受体细菌结构基因应能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。其次，