ELISA技术_原创精品文档.pdfVIP

Word文档

ELISA技术

ELISAELISA是酶联接免疫吸附剂测定Enzyme-Linked

ImmunosorbnentAssay的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后

进展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年月初问世以来，进展

非常快速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的很多领域。

一原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对

底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于

抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，

每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保

证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，详

细的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法图a、用于检测抗

原的双抗体夹心法图b以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞

争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

二操作步骤

方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋

白质含量为1～10g／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃

过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。简

1

Word文档

称洗涤，下同。

2.加样：加肯定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应

孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。同时做空白孔，阴性对比孔

及阳性对比孔。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新奇稀释的酶标抗体经

滴定后的稀释度0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶

液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观看结果：反应

孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜

色的深浅，以、-号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于

450nm若以ABTS显色，则410nm处，以空白对比孔调零后测各孔

OD值，若大于规定的阴性对比OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10g／ml，

每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。

加肯定稀释的待检样品未知抗体0.1ml于上述已包被

之反应孔

中,置37℃孵育1小时,洗涤。同时做空白、阴性及阳性孔对比

2

Word文档

于反应孔中，加入新奇稀释的酶标其次抗体抗抗体

0.1ml，

37℃孵育30-60分钟，洗涤,最终一遍用DDW洗涤。

其余步骤同双抗体夹心法的4、5、6。

三试剂器材

1.试剂

1包被缓冲液PH9.60.05M碳酸盐缓冲液:

NaHCO３1.59克

NaHCO３2.93克

加蒸馏水至1000ml

2洗涤缓冲液PH7.4PBS：0.15M

KH2PO40.2克

Na2HPO４12H2O2.9克

NaCl8.0克

KCl0.2克