分析GFP-Lc3和GFP-Gabarap转基因斑马鱼胚胎中的自噬活动.pdf

分析GFP-Lc3和GFP-Gabarap转基因

斑马鱼胚胎中的自噬活动

摘要：

自噬可介导大量胞内组分在溶酶体中的降解。在动物胚胎发育过程

中，卵黄蛋白的迅速降解和受精卵蛋白的合成导致胞内各结构的成型和细胞的分

化。斑马鱼是一种用来研究自噬的很独特的系统——部分是因为相对于其它生

物，斑马鱼的胚胎发育迅速。斑马鱼在技术上的优势使其特别适合于进行包括高

通量药物筛查在内的各类研究。为了研究斑马鱼体内的自噬，我们找到了2个斑

lc3gabarap

马鱼Atg8基因的同源基因——和，并培育出了表达连接有GFP标签

的上述2种蛋白质的2个转基因斑马鱼品系。与酵母的Atg8和哺乳动物的LC3

蛋白类似，斑马鱼Lc3蛋白的翻译后修饰也是从胚胎发育的咽胚期开始的。我们

观察到在斑马鱼胚胎中有高水平的自噬活动，而且这种自噬活动可以被TOR抑制

剂雷帕霉素或钙蛋白酶抑制calpeptin进一步上调。另外，自噬也会诱导斑马鱼

Gabarap在溶酶体中的累积。因此，我们建立了一种便捷的斑马鱼工具来分析活

体在胚胎发育过程中的自噬活动。

关键词：

胚胎发育；溶酶体；溶酶体探针；蛋白质靶向作用；应激

简介：

自噬是胞内发生的一种降解过程，它可以将胞质内的成分转运到溶

酶体中。自噬有多种形式，包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。研究的

最充分的是巨自噬，本文中将以“自噬”指代“巨自噬”。在自噬过程中，围绕

着要降解的胞内容物可形成双膜结构的囊泡——被称为自噬体。自噬体随后与溶

酶体融合，融合后自噬体内膜降解，其内容物随后被水解酶降解，降解后的大分

子物质被释放回胞质中以作为细胞的养料。对自噬的研究是很重要的，因为自噬

在人体的健康和病理过程（如主动免疫防御、抗原呈递、肿瘤抑制、心血管疾病、

胃肠道疾病、神经系统退行性疾病和人体的寿命）中均发挥作用。

ATG

对酿酒酵母进行高通量的突变筛查发现了大约31个与自噬有关的基因（

基因），这些基因中的多个在哺乳动物中都有其对应的同源基因。自噬需要2个

高度保守的泛素结合系统的参与。其中之一是泛素结合蛋白Atg12，它可被E1

酶（Atg7）活化，随即被E2酶（Atg10）转运并最终与其靶蛋白Atg5结合。第

二种泛素结合系统可促进泛素蛋白Atg8的C-末端的一系列反应过程，且Atg8

最终与磷脂酰乙醇胺（PE）结合。上述过程的发生首先需要Atg4分子对Atg8

分子的裂解作用，以及E1酶（Atg7）的活化，并转运至E2酶Atg3分子上，最

终将Atg8分子脂化。与大多数已知的自噬基因产物不同，大量的Atg8仍然残留

在自噬体中并被溶酶体所降解。这一独特的定位特性使得Atg8分子成为一种判

断生物体内（包括酿酒酵母、拟南芥、黑腹果蝇和小鼠）和细胞成熟过程中自噬

体的形成的有效工具。

人类大约有7种Atg8的等位基因，包括微管相关蛋白1轻链3（LC3）的3

种同工型（A、B和C）、γ-氨基丁酸A受体结合蛋白（GABARAP）及其L3同工型、

高尔基体相关ATP酶16kD增强子（GATE-16）和Atg8样蛋白（ATG8L），其中研

究的最充分的是LC3。LC3在饥饿环境下或在受到能上调自噬的化学药物处理的

情况下可以与PE结合。GABARAP与LC3有许多相似性，但其与PE的结合在饥饿

的环境下只受到轻微的影响，而且在某些条件下，GABARAP与PE的结合可以不

依赖mTOR的活化作用。GATE-16被认为参与了高尔基体内部的运输过程和有丝

分裂后高尔基体的重新装配。ATG8L是研究的最少的同源基因，GATE-16和ATG8L

在自噬中发挥的作用目前尚未充分理解。

尽管在过去的十年中在多种生物体内对自噬的研究进展迅速，但在斑马鱼中

对自噬的研究开展的还很少。这可能是由于目前缺少检测斑马鱼体内自噬的工具

所致。为了进一步在活体中研究斑马鱼的自噬