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实验六外周血单个核细胞的分离汇报人：文小库2024-01-16

CONTENTS引言实验原理实验步骤实验结果与分析实验注意事项与讨论总结与展望

引言01

研究免疫细胞功能和疾病机制01外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞等，是免疫系统的重要组成部分，研究PBMC有助于深入了解免疫细胞的功能和疾病发生机制。生物标志物的发现和验证02PBMC可用于发现和验证生物标志物，为疾病的诊断、治疗和预后评估提供重要依据。细胞疗法和基因编辑研究03PBMC的分离和培养是进行细胞疗法和基因编辑研究的基础，对于开发新的治疗方法和改善治疗效果具有重要意义。目的和背景

定义外周血单个核细胞（PBMC）是指血液中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞等。功能PBMC在免疫系统中发挥着重要作用，参与免疫应答、抗原提呈、免疫调节等过程，是机体防御病原体感染的重要屏障。分离方法PBMC的分离方法主要有密度梯度离心法、免疫磁珠法和流式细胞术等。其中，密度梯度离心法是最常用的方法，通过利用不同密度的分离液将PBMC从全血中分离出来。外周血单个核细胞概述

实验原理02

原理利用不同细胞在密度梯度液中的沉降速度不同，将外周血中的单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）与其他细胞分离开来。密度梯度液常用的是Ficoll-Hypaque密度梯度液，其密度介于1.077-1.090g/ml之间，与红细胞和粒细胞的密度相近，但低于单个核细胞的密度。操作步骤将外周血与等体积的密度梯度液混合，然后进行离心。离心后，红细胞和粒细胞会沉降至管底，而单个核细胞则悬浮在密度梯度液的上层，通过吸取上层液体即可获得单个核细胞。密度梯度离心法

原理利用单核细胞和巨噬细胞具有贴壁生长的特性，将外周血中的单个核细胞贴附在培养瓶或培养皿的底壁上，通过去除未贴壁细胞来获得单个核细胞。培养基常用的是RPMI-1640培养基，其中含有适量的血清和生长因子，有利于细胞的贴壁生长。操作步骤将外周血加入培养瓶中，静置一段时间使细胞贴壁。然后轻轻去除未贴壁的细胞，用培养基洗涤数次以去除残留的未贴壁细胞。最后加入适量的培养基继续培养贴壁的单个核细胞。贴壁分离法

010203原理利用特异性抗体与磁珠结合形成免疫磁珠，再与靶细胞上的特异性抗原结合形成复合物。在磁场作用下，复合物被吸附在磁场中而得以分离。免疫磁珠由磁性微粒和特异性抗体组成，其中磁性微粒可以是铁氧化物或稀土元素等磁性材料。操作步骤将外周血与特异性抗体标记的免疫磁珠混合，使免疫磁珠与靶细胞结合。然后将混合物置于磁场中，使复合物被吸附在磁场中。去除磁场后，收集未被吸附的细胞即为单个核细胞。免疫磁珠分离法

实验步骤03

采集对象健康成年人或实验动物。采集方法静脉穿刺采集外周血，一般采集量为10-20ml。注意事项采集前需对采集对象进行身体检查，确认无感染、炎症等疾病；采集时需使用无菌操作，避免污染。采集外周血

在离心管中加入适量淋巴细胞分离液，如Ficoll或Percoll等。离心管准备将采集的外周血沿管壁缓慢加入离心管中，注意避免血液与分离液混合。加样将离心管放入离心机中，以适当的速度和时间进行离心。离心后，管内液体分为四层，从上到下依次为血浆层、单个核细胞层、分离液层和红细胞层。离心密度梯度离心

用吸管小心吸取单个核细胞层，避免吸取到其他层的液体。吸取单个核细胞层将吸取的单个核细胞用PBS等缓冲液洗涤1-2次，去除残留的分离液和血浆。洗涤收集单个核细胞层

将收集的单个核细胞用PBS等缓冲液洗涤2-3次，每次洗涤后需进行离心以去除上清液。用适量的培养基或缓冲液重悬洗涤后的单个核细胞，以备后续实验使用。洗涤和重悬过程中需保持无菌操作，避免细胞污染；重悬时需根据实验需求选择合适的培养基或缓冲液。洗涤重悬注意事项洗涤与重悬

实验结果与分析04

细胞计数使用血细胞计数板对分离得到的单个核细胞进行计数，记录每毫升血液中的细胞数量。活性检测采用台盼蓝染色法检测细胞活性。将细胞悬液与台盼蓝染液混合后，在显微镜下观察并计算活细胞（未染色）和死细胞（染色）的比例，以评估细胞的活性状态。细胞计数与活性检测

细胞纯度鉴定形态学观察在显微镜下观察分离得到的单个核细胞的形态，记录细胞的形态特征和纯度。免疫学鉴定采用流式细胞术对分离得到的单个核细胞进行免疫学鉴定。通过特异性抗体标记目标细胞，如CD3、CD4、CD8等，以区分不同类型的免疫细胞，并计算各类型细胞的比例。

数据处理将实验数据进行整理、分类和统计，包括细胞计数、活性检测、纯度鉴定等结果。结果分析对实验数据进行综合分析，比较不同实验组之间的差异，探讨可能的影响因素。根据实验结果，评估外周血单个核细胞分离方法的可行性和有效性，为后续实验提供参考。数据处理与结果分析

实验注意事项与讨论05

进入实验室前