高效液相色谱简介及操作.ppt

（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯）（6）测定样品（7）清洗仪器色谱柱及流路清洗进样阀清洗进样针清洗第32页,共35页，2024年2月25日，星期天四、主要注意事项1泵使用的注意事项防止任何固体微粒进入泵体（用0.22um或0.45um的微孔滤膜过滤）流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、密封圈，最终产生漏液。输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性和分析结果。第33页,共35页，2024年2月25日，星期天2色谱柱使用的注意事项3其他注意事项色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般为甲醇）。每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁止直接进样分析。要注意流动相的脱气。避免使用高粘度的溶剂作为流动相。使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建议不超过两天，最好每天更换。第34页,共35页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第35页,共35页，2024年2月25日，星期天关于高效液相色谱简介及操作一、高效液相色谱概述及原理高效液相色谱法（HPLC）是在20世纪70年代在经典液相色谱和气相色谱的基础上迅速发展起来的一种高效、快速的分离分析技术。第2页,共35页，2024年2月25日，星期天1.色谱的演化色谱：由于不同的组分与固定相作用强弱不同，在一定的推动力下，它们在固定相中滞留的时间长短不一，从而使它们按一定顺序从色谱柱中先后流出。经典的柱色谱经典的柱色谱第3页,共35页，2024年2月25日，星期天渐渐地，人们以传统色谱为蓝本开发了气相色谱气相色谱示意图经典的柱色谱第4页,共35页，2024年2月25日，星期天高效液相色谱：效仿气相色谱，用高压输液泵将流动相输入高柱效色谱柱，使其在柱内快速流动，并在柱末端附加检测器检测分离情况。高效液相色谱就这样诞生了。第5页,共35页，2024年2月25日，星期天高效液相色谱仪就这样诞生了LCGCHPLC第6页,共35页，2024年2月25日，星期天填料颗粒小（2~10μm），受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加15~30MPa的高压。由于采用高压，载液在色谱柱内的流速可达l~10mL／min，因而所需分析时间少。使用细、规则、孔浅的颗粒做为固定相，分离效率大大提高。采用紫外、荧光、蒸发激光散射、电化学、质谱等检测器，检测灵敏度高。紫外检测器检测限可达0.01ng；荧光和电化学检测器可达0.1pg。2.为什么叫高效液相色谱???第7页,共35页，2024年2月25日，星期天HPLC和经典液相色谱法的比较第8页,共35页，2024年2月25日，星期天3.高效液相色谱法的分类通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。第9页,共35页，2024年2月25日，星期天4.如何阅读色谱图？？tR：保留时间；tM：死时间；：调整保留时间；W：峰宽第10页,共35页，2024年2月25日，星期天定性分析：在同一色谱系统中相同物质具有相同的保留值定量分析：组分含量与其响应值（峰高或面积）成正比第11页,共35页，2024年2月25日，星期天5.如何评价色谱峰？？柱效：描述被分离组分的集中程度。柱效越高，组分越集中，对应色谱峰的峰宽越窄。可用理论塔板高度H描述。H越小，柱效越高。选择性：描述不同组分的分离程度。选择性越高两个色谱峰顶相距越远。用R表示第12页,共35页，2024年2月25日，星期天（a）柱效和分离度都不好；（b）分离度高，柱效低；（c）理想色谱峰第13页,共35页，2024年2月25日，星期天用分离度R可以描述选择性和柱效的总效能R值越大，表明两组分的分离程度越高，R=1.0时，分离程度可达98%，R<1.0时两峰有部分重叠，R=1.5时，分离程度达到99.7%.所以，通常用R=1.5作为相邻两色谱峰完全分离的指标.第14页,共35页，2024年2月25日，星期天分析未知物质------联用技术色谱-质谱联用色谱-核磁共振联用色谱-傅氏转换红外线光谱分析仪联用第15页,共35页，2024年2月25日，星期天二、高效液相色谱仪的结构