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紫外-可见分光光度法二、紫外-可见分光光度计三、紫外-可见分光光度法应用一、紫外-可见分光光度法原理紫外-可见分光光度法电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大1~2个数量级，在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成所谓的带状光谱。分子的能量变化?E为各种形式能量变化的总和：紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法紫外—可见分光光度法是利用物质对紫外—可见光选择性吸收的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的一种仪器分析方法。?-胡罗卜素波长范围：200-760nm.(UltravioletandVisibleSpectrophotometry,UV-Vis)?1紫外-可见分光光度法定义UV-Vis方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的选择性吸收特性。UV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在200~760nm.UV-Vis主要用于分子的定量分析。灵敏度和准确度较高，仪器设备简单，操作方便，应用广泛等。2紫外-可见分光光度法分类和特点按吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法。紫外-可见分光光度法当强度为I0的入射光束通过装有均匀待测物的介质时，该光束将被部分吸收，未被吸收的光将透过待测物溶液以及通过散射、反射，包括在液面和容器表面的反射)而损失，那么：I0=Ia+It+Is+Ir一透光率与吸光度第一节基本原理当一束平行单色光，通过一均匀的溶液后，光的强度会减弱。I0=Ia+It入射光强度吸收光强度透过光强度一透光率与吸光度第一节基本原理除去发射、散射等影响后第一节基本原理吸光度A与透光率T：A=-lg（I/I0）A=-lgT透射比愈大或吸光度愈小，其介质对光的吸收愈小；透射比愈小或吸光度愈大，其介质对光的吸收愈大。即：T↑，溶液A↓；T↓，A↑透过光的强度It与入射光的强度I0之比称为透射比或透光度，用T表示：T=It/I0×100%吸光度：物质对光的吸收程度，用A表示。一透光率与吸光度第一节基本原理朗伯-比耳定律(Lambert－Beer)是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。式中比例常数k与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。C为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。物理意义：一束平行单色光通过一均匀、非散射的吸光物质稀溶液时，在入射光的波长、强度以及溶液温度等保持不变时，该溶液的吸光度A与其浓度C及液层厚度l的乘积成正比。二Lambert-Beer定律比例常数入射光波长物质的性质温度第一节基本原理吸光度具有加和性：Lambert-Beer定律适用范围：①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。②均匀、无散射溶液、固体、气体。二Lambert-Beer定律不仅适用于紫外光、可见光，也适用红外光；在同一波长下，各组分吸光度具有加和性A=A1+A2+??+An（1）入射光必须为单色光（2）被测样品必须是均匀介质（3）在吸收过程中吸收物质之间不能发生相互作用。影响定量的准确度！！！依据Lambert-Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面：（1）样品因素（2）光学因素（仪器因素）二Lambert-Beer定律第一节基本原理偏离Lambert-Beer定律的因素1）待测物高浓度--吸收质点间隔变小—质点间相互作用—对特定辐射的吸收能力发生变化---?变化；1.样品性质影响2）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；3）被测溶液不均匀导致的偏离二Lambert-Beer定律第一节基本原理4）由于溶液自身的化学反应导致的偏离溶液要求：均匀、无散射、化学环境稳定浓度较小的溶液。（c＜0.01mol/L）第一节基本原理偏离Lambert-Beer定律的因素二Lambert-Beer定律2.仪器因素仪器因素包括光源稳定性以及入射光的单色性等。a）入射光的非单色性：不同光对所产生的吸收不同，可导致测定偏差。b）谱带宽度与狭缝宽度：“单色光”仅是理想情况，经分光元件色散所得的“单色光”实际上是有一定波长范围的光谱带(即谱带