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携带IBV基因真核表达质粒的大肠杆菌工程菌发酵工艺研究的中期报告
中期报告
一、研究背景和意义
IBV（InfectiousBronchitisVirus）是一种嗜冷病毒，是卡氏二型冠状病毒（Coronaviridae，Nidovirales）的代表，引起鸡传染性支气管炎，是危害鸡农业的一种病毒性疾病。目前，针对IBV的疫苗主要是通过低致病毒株引起机体对病毒的保护，然而这种疫苗对IBV不同血清型的保护效果差异较大，而且常会造成回栏病的发生。因此，研究一种高效且全血清型保护效果都较好的疫苗是十分必要的。
基于这种情况，我们决定构建一种重组质粒，将IBV的特定抗原基因、蛋白质基因与IBV本身的基因相区分，使其可以被机体识别并产生一定的免疫反应，从而提高对IBV的保护效果。因此我们选用大肠杆菌作为IBV基因真核表达质粒的载体，以通过大肠杆菌发酵工艺来进行大规模的生产。
二、研究方法和实验设计
1.构建质粒
我们采用PCR技术，从IBV中提取抗原基因、蛋白质基因，并在其上设计序列，加入适当的限制性酶切位点。随后我们在PCR产物上使用限制性酶进行酶切处理，并将产生的DNA片段与大肠杆菌质粒pUC19连接，形成重组质粒pUC19-IBV。
2.转化大肠杆菌
我们将重组质粒pUC19-IBV转化到大肠杆菌DH5α中，利用PCR和限制性酶切鉴定转化后的有效菌株，筛选获得正确质粒低拷贝菌单。
3.构建表达质粒
利用pUC19-IBV重组质粒DNA为模板，进行PCR扩增，得到IBV基因真核表达质粒。扩增完成后，将扩增产物与pET28a(+)质粒连接，构建重组表达质粒pET28a(+)-IBV。
4.表达融合蛋白
将重组表达质粒pET28a(+)-IBV转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。构建pET28a(+)-IBV转化后的重组工程菌，通过ELISA法筛选抗原蛋白克隆。利用尿嘧啶特异性亚硫酸氢盐多肽切割酶处理7h，还原蛋白中及其结构，进一步提高疫苗免疫活性。
5.发酵工艺
构建重组蛋白工程菌后，设计大肠杆菌的发酵工艺。选定液体培养基，在1L发酵罐内进行多级发酵，控制发酵参数，收集发酵产物。
三、预期结果和成果分析
我们预计通过上述方法可以成功构建出IBV基因真核表达质粒，并实现该质粒的高效、大规模的生产。同时，我们还希望能够通过优化大肠杆菌的发酵工艺，实现高产、高纯度的抗原蛋白的生产。我们将利用SDS、Westernblotting等方法对产生的抗原蛋白进行鉴定和检测，以保证其免疫活性和安全性，并利用小鼠模型来评价其保护效果。预计这项研究的成果将为研究IBV疫苗提供一种新的思路和方法。
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