基于CRISPR_Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株.pdfVIP

第38卷第2期山东理工大学学报(自然科学版)Vol.38No.2

2024年3月JournalofShandongUniversityofTechnology(NaturalScienceEdition)Mar.2024

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文章编号:16726197(2024)02006706

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建

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PDL1GFP报告基因HT29细胞株

11,2113

谢钰珍,覃鸿妮,吴凡,孙曙光,孟丽君

(1.苏州工业园区服务外包职业学院生物科技学院,江苏苏州215123;

2.江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学),江苏苏州215000;

3.苏州东岭生物技术有限公司,江苏苏州215123)

利用-

摘要:CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PDL1基因的特定位置敲入绿色荧

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光蛋白(GFP)序列,构建含有PDL1GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据

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,

CRISPRCas9靶点设计原则,针对PDL1基因终止密码子设计两对sgRNA退火形成双链后连接

至-转化培养后提取质粒并测序验证--

LentiV2空载质粒中,。对于正确的LentiV2sgRNA重组质

++

粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂GFP右同源臂序列合成Donor

片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的

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LentiV2sgRNA和pUC19donorGFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落

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PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PDL1的

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Cas9载体LentiV2gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19donorGFP构建成功。两个重组质

粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细

胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的

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基因组PCR均检测到特异条带,表明在PDL1终止密码子前成功插入了GFP片段,细胞株构建成

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功。通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PDL1GFP报告基因的HT29结肠癌细胞株