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其他沉淀法等电点沉淀法成盐沉淀法高分子聚合物沉淀选择性变性沉淀法三、其他沉淀方法1.等电点沉淀法两性物质在pH=pI时，分子表面净电荷为零，分子间静电排斥作用减弱，因此吸引力增大，能相互聚集，发生沉淀。不同的两性物质，pI不同，如不同蛋白质。根据这一特性，用依次改变溶液pH的方法可将不同的蛋白质分别沉淀析出，达到分离纯化的目的。只适用于水化程度不大、在pI时溶解度很低的两性物质，如酪蛋白。对于亲水性很强的两性物质，在pI及pI附近仍有相当的溶解度，用该法沉淀不完全，而且许多生物分子的pI很接近，因此很少单独使用。往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法结合起来。采用该法时必须注意：溶液pH不会影响到目的物质的稳定性。等电点沉淀法可用于所需物质的提取，也可用于沉淀除去杂蛋白及其他杂质，实际工作中普遍采用该方法作为去杂手段。如在工业上生产胰岛素时：先调pH至8.0去除碱性杂蛋白，再调pH至3.0去除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大大提高，有利于后面的操作。2.成盐沉淀法某些生化物质（如核酸、蛋白质、多肽、氨基酸、抗生素等）能和重金属、某些有机酸及无机酸形成难溶性的盐类复合物而沉淀。金属离子沉淀法有机酸沉淀法无机酸沉淀法注意：形成复合盐后，常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用时必须谨慎。（1）金属离子沉淀法许多有机物（包括蛋白质）在碱性溶液中带负电荷，因此能与金属离子形成金属复合盐沉淀。根据与有机物作用的机制不同，可将金属离子分为三类：①能与羧基、含氮化合物和含氮杂环化合物结合，如Mn2+,Fe2+,Co2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+等②能与羧基结合，但不能与含氮化合物结合，如Ca2+,Ba2+,Mg2+,Pb2+等③能与巯基结合，如Hg2+,Ag+,Pb2+等分离出沉淀物后，如何去除金属离子？可用H2S使金属变成硫化物而除去，也可采用离子交换法或金属螯合剂EDTA等将金属离子除去。金属离子沉淀法除提取生化物质外，还能用于沉淀去除杂质：如锰盐能选择性的沉淀发酵液中的核酸，降低发酵液黏度，以利于后续操作；ZnSO4能沉淀红霉素发酵液中的杂蛋白以提高过滤速度。（2）有机酸沉淀法（有机酸：具有酸性的有机化合物）某些有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸和三氯乙酸等，能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。这些有机酸与蛋白质形成盐复合物沉淀时，常发生不可逆的沉淀反应，所以用此法制备蛋白质和酶时，需采用较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。①鞣酸（单宁）—多元酚类化合物分子上有羧基和多个羟基，蛋白质分子中有氨基、亚氨基和羧基，所以可与单宁分子形成为数众多的氢键而结合在一起，生成巨大的复合颗粒而沉淀下来。如何使蛋白质游离释放出来？单宁与蛋白质的结合比较牢固，不易分开，多采用竞争结合法：用比蛋白质更强的结合剂与单宁结合，竞争性结合剂有PVP（与单宁形成氢键的能力很强），聚乙二醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇甘油酸酯②三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白质迅速且完全，一般会引起变性。低温下短时间作用可使某些较稳定的蛋白质或酶保持原有活力，多用于目的物较稳定且分离杂蛋白相对困难的场合。③雷凡诺—吖啶染料沉淀机制比一般有机酸盐复杂，但与蛋白质作用也主要是通过形成盐的复合物而沉淀的。提纯血浆中γ-球蛋白有较好效果。（3）无机酸沉淀法（无机酸：能解离出氢离子的无机化合物，如硫酸、盐酸、硝酸、次氯酸等；有机酸：具有酸性的有机化合物，最常见是羧酸）某些无机酸如磷钨酸、磷钼酸等能与阳离子形式的蛋白质形成溶解度极低的复合盐，使蛋白质沉淀析出。无机酸如何去除？得到沉淀物后，可在沉淀物中加入无机酸并用乙醚萃取，把磷钨酸、磷钼酸等移入乙醚中除去；或用离子交换法除去。3.高分子聚合物沉淀某些水溶性的非离子型高分子聚合物是20世纪60年代发展起来的沉淀剂，近年来被广泛用于核酸、蛋白质和酶的分离纯化，包括不同分子量的聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等。应用最多的是PEG，原因：无毒，对成品影响小（1）用水溶性非离子聚合物沉淀生物大分子和颗粒的两种方法：①选用两种水溶性非离子多聚物组成液-液两相系统，使生物大分子或颗粒在两相系统中不等量分配，进行分离。机理：不同生物分子和颗粒表面结构不同，有不同分配系数；且外加离子强度、pH和温度等的影响，提高分离效果。②选用一种水溶性非离子