课题多聚酶链式反应扩增片段.ppt

关于课题多聚酶链式反应扩增片段脱氧核糖含氮碱基磷酸AGCT1、DNA的基本单位－脱氧核苷酸一、DNA分子的结构12345O第2页,共28页，2024年2月25日，星期天鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸2、脱氧核苷酸的种类A腺嘌呤脱氧核苷酸GCT第3页,共28页，2024年2月25日，星期天第4页,共28页，2024年2月25日，星期天ATGCAGCT3、DNA分子的平面结构氢键5端3端5端3端第5页,共28页，2024年2月25日，星期天4、DNA的立体结构

——双螺旋结构第6页,共28页，2024年2月25日，星期天2、时间：细胞分裂间期（有丝分裂间期，减数第一次分裂的间期）1、概念：以亲代DNA为模板，根据碱基互补配对合成子代在DNA的过程。3、场所：主要是细胞核（其次是线粒体、叶绿体）二．细胞内DNA复制的过程第7页,共28页，2024年2月25日，星期天4、条件：①模板：亲代DNA的两条母链②原料：游离的四种脱氧核苷酸③能量：ATP④酶：解旋酶、DNA聚合酶⑤引物：一小段RNA，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对5、过程（1）解旋：解旋酶、ATP（2）以DNA的两条母链为模板，根据碱基互补配对规则，合成子链。（3）子链、母链螺旋构成子代DNA第8页,共28页，2024年2月25日，星期天DNA体内复制（示意）第9页,共28页，2024年2月25日，星期天6、复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。7、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸第10页,共28页，2024年2月25日，星期天条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶TaqDNA聚合酶不需要催化合成DNA子链能量ATP不需要引物一般是一小段DNA使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸1、PCR的技术（DNA体外复制）的条件DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）一、PCR的原理（PCR的技术原理）第11页,共28页，2024年2月25日，星期天一、PCR的原理（PCR的技术原理）1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1~3步30轮3、DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸2、步骤：变性——复性——延伸第12页,共28页，2024年2月25日，星期天PCR技术的原理总结利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：子链的5’端向3’端延伸。第13页,共28页，2024年2月25日，星期天二、PCR的反应过程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/第14页,共28页，2024年2月25日，星期天5?引物15?引物2第二次复制第一次复制5?5?5?5?5?5?模板DNA5?5?5?5?5?5?5?5?25～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。第15页,共28页，2024年2月25日，星期天每个循环包括：变性——复性——延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。PCR的反应过程总结第16页,共28页，2024年2月25日，星期天三、PCR反应的实验操作1、PCR仪设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上一台能够自动调控温度的仪器第17页,共28页，2024年2月25日，星期天三、PCR反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（