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大肠杆菌染色体的DNA的提取——刘昌烨实验目的了解大肠杆菌染色体的DNA的提取方法学会操作其中的一两种学习通过实验现象分析实验结果进一步联系提取方法，了解实验器材的使用实验用品1、台式离心机2、电泳设备3、凝胶成像系统实验内容1、沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA
2、碱溶法制备大肠杆菌质粒DNA
3、沸水浴制备染色体DNA
4、大肠杆菌中染色体DNA的抽提
沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA(1)在Eppendorf管中加入110ml的STET(使用前加入溶菌酶至终浓度为5mg/ml)溶液,挑入米粒大小的菌团,充分悬浮并混匀.
(2)上述菌体悬浮液沸水煮20秒.
(3)迅速放置于常温下15000rpm离心15分钟.
(4)用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),在上清液中加入100ml的异丙醇(注意不同样品管中的溶液平衡),充分混匀后15000rpm离心15分钟.
(5)弃上清液,沿管壁四周加入70%冰乙醇400ml洗涤上述所得DNA样品,完毕后弃上清,管子倒扣10S左右,然后将DNA沉淀凉干.
(6)沉淀凉干后用50ml无菌重蒸水溶解,样品可取5ml酶切电泳分析或待用.
碱溶法制备大肠杆菌质粒DNA(1)取1.5ml过夜细菌培养液于1.5ml离心管中,于台式高速离心机中以15000rpm,常温离心30秒,弃去上清液并将离心管倒扣在滤纸上.(4管/组)
(2)在离心管中加入100ml溶液I悬浮菌体,涡旋振荡,以充分悬浮菌体成均匀悬浮液.
(3)加入200ml溶液II,扣上离心管盖,立即轻轻混匀(来回颠倒数次),至溶液几乎澄清,成淡黄色透明粘液状.
(4)打开离心管盖,加入150ml溶液III,轻轻混匀(来回颠倒数次),看到淡黄色消失,有大量白色沉淀生成,然后离心.
(5)常温15000rpm离心10分钟,小心吸取上清液于另一离心管中.注意,不要把白色絮状物混入上清液中.
(6)清液中加入等体积的苯酚饱和溶液:氯仿混合溶液(1:1)(各200ml),充分混匀,常温15000rpm离心10分钟,小心将上清液转移至另一离心管.注意不要将下层有机相混入上清液中.
(7)在上清液中加入-20℃冷冻的异丙醇600ml,充分混匀,常温15000rpm离心10分钟.
(8)小心倾去上清液,注意避免把离心管底的白色DNA沉淀也随同上清倒掉.加入400ml75%的冰乙醇,再15000rpm离心1min,倾去上清,倒扣离心管于滤纸上,稍许凉干.
(9)加入100ml无菌重蒸水溶解质粒DNA,可在37℃保温5~10分钟.(100ml/管,4管)
(10)合并于一管,加入2mlRNase,37℃保温30分钟,取5ml电泳检查消化彻底否.(以电泳前端无RNA条带为准)沸水浴制备染色体DNA(1)在Eppendorf管中加入100ml的ddH2O,挑入米粒大小的菌团,充分悬浮并混匀.
(2)上述菌体悬浮液沸水煮20秒.
(3)迅速放置于常温下15000rpm离心10分钟.
(4)用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),上清待用.
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