酚提取蛋白分析和总结.docxVIP

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2024-04-12 发布于上海
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酚提取蛋白分析和总结.docx

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蛋白质采用酚提取法。两克植物组织在液氮下磨成粉末，并且在冰浴中与6ml冰冻提取

buffer（250mM蔗糖，20mMTris-HClph7.5，10mMEGTA，1m

MPMSF,1mMDTT）摇匀10分钟。加入等量的冰冻Tris-HCl（PH7.5）苯酚的饱和溶液，混合液在冰浴中摇匀10min。离心（20min，15，000g，4℃），提取酚相溶液重复两次。蛋白质用三倍于酚相体积的含有100mM醋酸铵的甲醇溶液中过夜（-20℃）。沉淀的固体用冰冻的含有13mM的DTT丙酮溶液洗涤三次，然后低压冻干。

凝胶内消化与蛋白鉴定

把蛋白斑从凝胶上手动切下，凝胶内消化采用胰蛋白酶，步骤如下：切下的胶条在25%(v/v)酒精洗涤，并且在7%（v/v）的醋酸中过夜（室温），然后胶条用含有50mMNHHCO3的50%（v/v）甲醇溶液褪色1h（40℃）.蛋白用含10mMDTT的100mMNHHCO3溶液中还原1h（60℃），并且在黑暗中用含有40mM乙酰胺的100mMNHHCO3乙酰化30min（室温）。把凝胶切碎，冻干，然后在浸泡在还有10ng测序级的改胰蛋白酶的25mMNHHCO3溶液中过夜（37℃）。经过消化，收集多肽。固体小球用0.1%TFA的50%(v/v)的乙腈溶液洗涤三次以收集剩余的多肽。提取液中的多肽用ZipTipC18P.去除盐分。

液相色谱检测用surveyorLCsystem进行。C18从ColumnTechnology购得。流动A相由0.1%

的蚁酸水溶液，流动相B则由0.1%的蚁酸乙腈溶液。胰蛋白酶肽混合物用流动相B2-98%的浓度梯度提取180min。串联质谱检测用配备了电喷雾接口并且在阳离子模式下运行的LTQ线性离子阱回旋组合质谱仪。毛细管的温度设定为170℃，喷射电压设定为3.4kv。得到的图谱用Bio-Works3.1softwaresuite的TurboSEQUESTprogram在NCBI的蛋白数据库中搜索写复位信号。如果没有可信的候选匹配就搜索十字花科的拟南芥蛋白数据库。