重亚硫酸盐测序操作方案.docx

■亚硫酸盐测序操作方案

一、样品收集

1、 配制2%低熔点琼脂糖

称取0.02g低熔点琼脂糖，倒入1.5mL离心管中，随后加入1mLmPBS溶液，置于100°C金属浴中反复加热并颠倒混匀至完全溶解，取出4^保存待用。

2、 收集细胞样品

80C以上热水浴使低熔点琼脂糖溶化。向1.5mL离心管底部加入8险低熔点琼脂糖，避免产生气泡。迅速吸取细胞样品吹入琼脂糖中，冷却后加入500L矿物质油覆盖。最后将离心管在热水浴中短暂浸泡使琼脂糖小球成型，取出-20X保存待用。

二亚硫酸氢盐修饰

3、配制DNA细胞裂解液：向20mLTE缓冲液中加入100pL的20mg/ml蛋白酶K。

4、向含样品的离心管内加入500pLDNA细胞裂解液，50X金属浴8h以上，以消化样品。

5、在上一步消化进行的同时配制转化液，注意避光

亚硫酸氢钠

4.75g

双蒸水

4.5mL

2MNaOH

3.5mL

对苯二酚

0.138g

共计

10mL

6、消化完成后，将离心管取出，换液清洗使小球变性:

0.3MNaOH,500pL,15min,2次；0.1MNaOH,1mL,5min,1次。

7、换液加入500pL转化液，50X金属浴8h以上，以转化样品，注意避光。

8、用TEft冲液中止转化，1mL,15min,6次。

9、用0.2MNaOH脱磺化，500pL,15min,2次。

10、 用TE^冲液中止脱磺化，1mL,15min,3次。

11、 用双蒸水清洗，1mL,10min,2次。

12、 清洗完成，用枪头吸取琼脂糖小球转移至200口1离心管中，-20C保存待用。

甲基化基因的PCR

13、使用设计好的两对甲基化特异性引物对转化后的DNA样品进行巢式PCR反应。

步骤

预变性

变性

退火

延伸

终延伸

降温

温度

94C

94C

55~65C

72C

72C

4C

时间

2min

30s

30s

30s

2min

8

第一轮反应体系25陀，转化后琼脂糖小球计为2pLDNA。第二轮反应体系扩大为50rLo

试剂

25pL反应体系

50pL反应体系

2xTaqMasterMix

12.5

25

RNase-FreeWater

8.5

19

ForwardPrimer,10pM

1

2

ReversePrimer,10pM

1

2

TemplateDNA

2

2

14、将第二轮反应产物全量加入胶孔中，跑胶时尽量跑完全程以分离杂带。在紫外灯下找到目的条带，快速精确切取，将胶块放入1.5mL离心管内。

15、对胶块称重，向离心管内加入3倍胶体积（0.1g=100叽）QGBuffer,50°C金属浴至胶融化，同批样品可统一为450pL,以便于离心。

16、加入1

16、

加入1倍胶体积（150pL）异丙

，颠倒混匀后将液体移入离心柱离心,

13000g,1min。

17、 倒掉收集管内液体，向离心柱内加入500叽QGBuffer，再次离心，13000g,1min。

18、 倒掉收集管内液体，加入750pLPEBuffer，静置2min，再次离心，13000g,1min。

19、 更换收集管再次离心，13000g,1min,倒置离心柱在滤纸上晾干2min，再插入新收集管。

20、 将25pLEBBuffer精确加至离心柱中心内膜，静置3min后离心，18000g,10min。

21、 取少量收集管内DNA溶液检测样品浓度（分光光度计或跑胶检测），余下-20C保存待用。

微■分光光度计：测定DNA浓度并记录，连接

微

■分光光度计：测定DNA浓度并记录，连接T载体时稀释各组至合适的统?

浓度。

,跑

胶：取5pLDNA^S与1

pL6xloadingbuffer混合，点样跑胶检测目的条带，依据目的

条带亮度决定连接T载体时的DNA上样量。（亮1pL;中等2pL;弱3pL）

五、克隆测序

22、预先制冰，将pMD18-TVectorCloningKit冰上解冻，依次向200口1离心管内添加:

高DNA浓度

中DNA浓度

低DNA浓度

双蒸水

3pL

2pL

1pL

共计

5pL

1pL顼

pL

pL

1pL

3pL

混匀后，加入5pLSolutionI;再次混匀，放入PCR仪中16°C连接8h。

T?体

DNAWS23、在上一步连接进行的同时，配制LB/AMP培ffS(1)配制LB液体培^S(200

T?体

DNAWS

1%(w/v)Tryptone

2