蛋白表达技术 ppt课件.pptxVIP

蛋白表达技术;蛋白表达技术;蛋白表达的涵义;一、原核表达系统;Strain;表达载体; 复制起始点：保证载体可以正确复制和增殖，决定质粒载体在宿主中的拷贝数。

克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子

通常表达载体都会选用高拷贝的复制子

选择性基因-筛选标记：

蓝白斑筛选（主要用于克隆）、营养缺陷性筛选、抗生素筛选（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等）。; 复制起始点：保证载体可以正确复制和增殖，决定质粒载体在宿主中的拷贝数。

克隆载体常采用拷贝数低、严谨复制的复制子

通常表达载体都会选用高拷贝的复制子

选择性基因-筛选标记：

蓝白斑筛选（主要用于克隆）、营养缺陷性筛选、抗生素筛选（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等）。

多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。; 启动子：能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列

转录形式：组成型、诱导型

强弱：取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。

—表达载体通常选用强启动子以提高表达量，但弱启动子也有其优点，如降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。;T7启动子----最常用启动子

基于T7RNA聚合酶及其强启动子之间的特异性和转录的高效性建立的pET系统(No-vagen)是最常用的E.coli表达系统。T7NAP

机制在诱导蛋白表达时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白，而且表达产物产量也特别高。; 终止子：终止点前含有一段7-20bp的回文序列，可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。

融合标签：利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。

□标签位置的选择：

----N端融合：易于构建。终止密码子来自载体基因，表达量高提前终止会干扰纯化二级翻译起始，不影响纯化

----C端融合：构建时注意避免移码，基因不能自带终止密码子，提前终止不影响纯化，二级翻译起始会干扰纯化;TrxHIS

His6是指六个??氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

优点：

标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；

His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下（纯化疏水性强的蛋白）或变性条件（纯化包涵体蛋白）下纯化，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；

His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；

His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。

可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；

可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。;Flag标签蛋白

Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

优点：

FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。

融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。

FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过WesternBlot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。;MBP（麦芽糖结合蛋白）

MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。

优点：

MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。

MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签

如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。;GST(谷胱甘肽巯基转移酶)

GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。可直接从细菌裂解