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毕赤酵母发酵过程甲醇补料策略优选

Summary:总结优化目前的甲醇补料方式，结合实际生产情况，以根据在线溶氧即时反应情况，使用不同浓度的甲醇甘油混合溶液的分批补料策略以提高甲醇

诱导的前体蛋白的表达量。

Keys:原料药生产；毕赤酵母；甲醇诱导

引言

目前生物医药主要诱导产物系统有大肠杆菌IPTG诱导系统，毕赤酵母甲醇表达系统，哺乳动物细胞系统，昆虫细胞系统。其中，毕赤酵母的表达系统与原核生物的表达系统相比，可以分泌外源蛋白到胞外和具有蛋白翻译后增加修饰的能力，表达在大肠杆菌中难以表达或者产量较低的物质。因此具有生产成本较

低，产物应用方面广，产能大等诸多优点。

1、毕赤酵母的研究现状

巴斯德毕赤酵母广泛应用于各种规模的的蛋白质表达、制备以及结构分析等方面，已经有数以千计的外源蛋白在毕赤酵母系统中得到成功地表达。巴斯德毕

赤酵母的在工业发酵的大规模应用上有着以下五个优点：

(1)能够在碳源只有甲醇的培养基上存活并且生长。由于巴斯德毕赤酵母体内含特殊的醇氧化酶，能够在碳源或能源只有甲醇的培养体系中存活并且生长几乎不受抑制，甚至能够达到非常高的菌体数量。在这里。甲醇是醇氧化酶的诱导剂；

而当以Glu作为碳源时，AOX1启动子几乎不表达，以甘露醇山梨醇等为底物时，

醇氧化酶不会被抑制。

(2)表达高效、生长迅速，在一般培养基中依旧能到非常高的菌浓，和独特AOX1基因强启动子，是较为适宜的表达载体，外源蛋白的表达产量甚至可以达到蛋白

总数四成。

(3)适用于表达分泌到不同场所的蛋白。

(4)基因遗传具有高稳定性。被插入的基因不是像大肠杆菌那样导入到会独立遗传的质粒当中，而是随载体同源重组整合到染色体上，随酵母的繁殖一起遗传，极

大避免了外源基因的丢失现象。

(5)能够进行蛋白的糖基化修饰：N-、0-糖基化对于蛋白正确折叠、发挥相应的药物活性非常重要。毕赤酵母外源蛋白的糖基化程度较低。同时，毕赤酵母分泌的外源蛋白具有的抗原性远远低于其他酵母。这一点在一定程度上避免在药物

使用中引起免疫反应。因此，分泌的蛋白更适合于药物治疗用途。

近些年，毕赤酵母被FDA认定GRAS微生物，在医药蛋白领域，已有胰岛素、疫苗、表皮生长因子等多种蛋白使用实现商品化制备，在工业酶制剂领域，也有

许多酶制剂实现了工业化生产。

2、毕赤酵母表达药物概述

发酵是生物大规模培养中最早被人们认识和利用的。众多领域广泛应用，使这

一技术在经济发展中有着重要的作用。在生产中试放大过程中，除了菌种的优

劣，培养基的配置、接种时间、培养条件、诱导方式都是会对发酵产物的最终结果有着很大的影响。发酵放大生产并不是所谓的同比例放大，它要考虑多方

面的因素，需要优化来寻找最优的发酵方案。

本研究拟在巴斯德毕赤酵母表达药物前体蛋白的发酵放大试验生产中，选择合适的甲醇补加策略以探究出适宜的工艺参数来控制酵母代谢合成方向，增加药

物产物表达，提高产量。

3、甲醇补加策略

在发酵过程中，由于甲醇本身带有的毒性会影响菌体的生长代谢，因此甲醇补加策略的优劣是最终产物表达量多少的关键。目前一般采用三种方式来控制甲

醇的添加：(1)根据在线DO变化趋势控制甲醇补料。(2)通过气相色谱监测

定期离线检测甲醇浓度，以此为依据控制补料。(3)甲醇与不同碳源物质混合

后补料。

3.1根据在线DO变化趋势控制甲醇补料

在发酵过程中，通过一系列电极变送器等等可以在线显示数值的设备实时监测出pH、溶氧(DO)等参数的变化，直接反映发酵罐中营养成分消耗情况和菌株的生长状况。在毕赤酵母的发酵培养基中，碳源通常成为限制因素。当碳源消耗完时，菌体的代谢减弱，呼吸变少，氧气消耗减少使得培养基中的DO值会上升；这时如果继续向发酵罐中补加碳源，菌株的代谢将会增强，呼吸变多，氧气消耗增大就会使得DO值下降。根据这个原理，就可溶氧电极在线检测的

DO值的变化状况以及变化趋势来控制发酵过程中甲醇的补加。

但是由于无法在线检测发酵罐内培养液的甲醇浓度，使得利用在线检测的DO值

的变化状况控制甲醇流加并不是十分有效。尤其是当甲醇补料的速度大于菌体

消耗甲醇的速度，这使得流加的甲醇不断在培养基内累积。最终甲醇的浓度过高，对菌体生长代谢产生负面影响，菌体氧气消耗减少，此时测得的在线DO值的变化趋势反而是上升的。但是发酵罐内真正的菌体生长情况却是不容乐观的。这样就会使得生产人员在不知情的情况下错误的继续补加，结果就会导致

毒性过高，菌株生长受到抑制甚至死亡。

因此单一的利用在线检测的DO值的变化状况来控制毕赤酵母发酵过程中甲醇

的补加并不是一种合适的甲醇补料策略。

3.2通过气相色谱监测定