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分子标记技术及其在农业上的应用
摘要:分子标记技术随着分子生物学的发展而取得了较快的进展,而
且分子标记技术被广泛的用于农业生产。
关键词:分子标记分子生物学农业生产
分子标记技术的概念
分子标记是以个体间遗传物质内核甘酸序列变异为基础的遗传标记,是
DNA水平遗传多态性的直接的反映。随着分子生物学技术的发展,现在DNA分
子标记技术已有数十种,广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲
缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记技术的主要特点
1、具有高的多态性。
2、共显性遗传,即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型。
3、能明确辨别等位基因。
4、遍布整个基因组。
5、除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组。
6、选择中性(即无基因多效性)。
7、检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)。
8、开发成本和使用成本尽量低廉
9、在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。
与形态标记、生物化学标记、细胞学标记相比,具有以下优越性
1、大多数分子标记为共显性,对隐性的性状的选择十分便利。
2、基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的。
3、在生物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析。
4、分子标记揭示来自DNA的变异。
5、表现为中性,不影响目标性状的表达,与不良性状无连锁。
6、检测手段简单、迅速。
主要分子标记技术的基本原理
RFLP标记基本原理:
利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大
小不等的DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上
不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段,就形成不同带,然后与
克隆DNA探针进行southern杂交和放射显影,即获得反映个体特异性的RFLP
图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。
由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识
别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。
RAPD标记基本原理:
它是利用随机引物(一般为8—10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA片段,
然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基
因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同,但对任一特定引
物,它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生
DNA片段插人、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变
化,从而导致扩增产物数量和大小发生改变,表现出多态性。就单一引物而言,
其只能检测基因组特定区域DNA多态性,但利用一系列引物则可使检测区域扩
大到整个基因组,因此,RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测,也
可用于构建基因组指纹图谱。
与RFLP相比,RAPD具有以下优点:
1、技术简单,检测速度快。
2、RAPD分析只需少量DNA样品。
3、不依赖于种属特异性和基因组结构,一套引物可用于不同生物基因组分析。
4、成本较低。
RAPD也存在一些缺点:
1、RAPD标记是一个显性标记,不能鉴别杂合子和纯合子。
2、存在共迁移问题,凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段,而不能分开那些
分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段。
3、RAPD技术中影响因素很多,所以实验的稳定性和重复性差。
SSR标记基本原理:
根据微卫星序列两端互补序列设计引物,通过PCR反应扩增微卫星片段,
由于核心序列串联重复数目不同,因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的
PCR产物,将扩增产物进行凝胶电泳,根据分离片段的大小决定基因型并计算
等位基因频率。
SSR具有以下一些优点:
1、一般检测到的是一个单一的多等位基因位点。
2、微卫星呈共显性遗传,故可鉴别杂合子和纯合子。
3、所需DNA量少。
AFLP标记基本原理
先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段,再使
双链人工接头的酶切片段相边接,作为扩增反应的模板DNA,然后以人工接头
的互补链为引物进行预扩增,最后在接头互补链的基础上添加1—3个选择性核
苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离检测获得的DNA扩增片段,根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由
三部分组成:与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3’
端的选择碱基序列(1—10b
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