激光共聚焦技术.ppt

XbaI,SmaI,BamHI目的蛋白细胞器定位观察含有荧光蛋白的载体pA7-GFPCaMV35SPromoterXhoI,NcoI,SalI,SpeIGFP目的基因第20页,共23页，2024年2月25日，星期天目的蛋白细胞器定位观察对提取的质粒，用目的基因的引物进行PCR鉴定，出现了目的片段。根据pA7-GFPVector上提供的酶切位点，对重组质粒进行双酶切，酶切后进行电泳分析，也出现了目的片段，表明目的片段已经和质粒DNA重组。图3-9pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定酶切：重组质粒酶切产物；M：MarkerDL2000；PCR：重组质粒PCR产物第21页,共23页，2024年2月25日，星期天目的蛋白细胞器定位观察含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20μL分别加入1.5mL离心管中，分别加入500μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。(2)分别取4片约1.5cm*1.5cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。(3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。(4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。(5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。(6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水培养16小时。第22页,共23页，2024年2月25日，星期天目的蛋白细胞器定位观察BrightGFP MergedTTG1在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测A-C：GFP蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；D-F：TTG1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的表达；A、D：透射光下的表皮细胞；B、E：发射光下的洋葱表皮细胞；C、F：发射和透射复合光下的洋葱表皮细胞35S:GFPa bc35S:BrTTG1-GFPdef第23页,共23页，2024年2月25日，星期天关于激光共聚焦技术ZeissLSM510META激光共聚焦显微镜的基本结构激光光源冷却系统扫描器光学装置荧光显微镜系统图象存储与处理及控制系统针孔光栏分光镜发射荧光单色器检测器第2页,共23页，2024年2月25日，星期天激光扫描共聚焦显微镜（LSM）是当今世界上最先进的分子生物学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，观察细胞的形态变化或生理功能的改变。成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域中新的有力研究工具。第3页,共23页，2024年2月25日，星期天激光共聚焦显微镜在生物学中的应用原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构检测核酸检测蛋白质细胞定位检测细胞凋亡细胞器的观察及测定检测细胞融合观察细胞骨架检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞内脂肪活体细胞或组织功能的实时动态监测实时定量测定细胞内Ca2+变化测定细胞内pH变化检测膜电位变化检测细胞内活性氧物种的产生检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位检测荧光共振能量转移检测荧光漂白恢复第4页,共23页，2024年2月25日，星期天荧光显微镜系统激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点。需与扫描器连接。使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器。需有光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。荧光镜座要有防震动装置。第5页,共23页，2024年2月25日，星期天激光共聚焦显微镜工作原理示意图激光经放大、分光后由物镜聚焦于焦平面上，同时，焦平面上被激光扫描的点F所发出的一定波长的荧光通过检测针孔光栏达到检测器，并成像于显示器上，得到相应的荧光图象。第6页,共23页，2024年2月25日，星期天激光共聚焦显微镜基本操作获取共焦图像的步骤在VIS模式中观察样品

装入LSM配置

扫描图像

保存图像第7页,共23页，2024年2月25日，星期天不同厚度光切图像第8页,共23页，2024年2月25日，星期天