激光扫描共焦显微镜技术.ppt

细胞内生理Ca2+浓度值（10-8-10-7M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）2）标准曲线法根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA-Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度3）比例荧光的测量.双波长(比例荧光：ratio)Indo1(360,420/480),fura2(340/380,440)[Ca2+]I=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光扫描共焦显微镜应用第32页,共48页，2024年2月25日，星期天激光扫描共焦显微镜应用快速Ca2+变化的测量1.改变扫描速度2.采用双向扫描3.减少采样点数(牺牲空间分辨率）4.采用线扫描(xt)第33页,共48页，2024年2月25日，星期天细胞器的Ca2+测量1.线粒体内游离Ca2+测量Fluo-3+TMRM(线粒体荧光探针，红色）2.特异定位的重组水母发光蛋白水母发光蛋白与Ca2+结合后发蓝光用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化 目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测激光扫描共焦显微镜应用第34页,共48页，2024年2月25日，星期天细胞内游离Ca2+测量的应用钙的特性1．细胞内外的电化学梯度103-104倍2．细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致胞内钙明显升高3．细胞内钙为细胞激活“开关”细胞内钙的生理作用1．肌肉的兴奋收缩-收缩偶联2．神经递质的释放3．学习记忆的增强4．卵子受精5．细胞分裂和再生6．细胞调亡7．细胞间通讯激光扫描共焦显微镜应用第35页,共48页，2024年2月25日，星期天8．细胞信号传导9.DNA合成10.基因表达细胞内钙超载与疾病1．高血压、脑缺血、心脏病、内分泌病—胞内钙浓度异常2．糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化病—胞内钙浓度增高3．人体缺钙—骨钙大量丢失，神经细胞的钙浓度增高4．老化和老年性痴呆-神经细胞内钙浓度增高细胞内生理Ca2+浓度值（10-8-10-7M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）激光扫描共焦显微镜应用第36页,共48页，2024年2月25日，星期天电刺激引起骨骼肌细胞的Ca2+振荡激光扫描共焦显微镜应用第37页,共48页，2024年2月25日，星期天激光扫描共焦显微镜应用pH值的检测：BCECF-AM 490nm530nm6.5-7.5Snarf-1-AM488nm580/640nm7.0-8.0第38页,共48页，2024年2月25日，星期天自由基的检测荧光探针：H2DCF-DA（504nm/529nm） 2-氢，2氯荧光素乙酰乙酸盐胞外H2DCF-DA扩散入细胞内酯酶脱乙酰DCF-H(不荧发光）DCF（发荧光）*样品不能在镜下用汞灯照射及观察Dihydrorhodamine123（507nm/529nm）H2rhod123被动扩散入细胞内在细胞内被氧化成rod123（发光）激光扫描共焦显微镜应用第39页,共48页，2024年2月25日，星期天激光扫描共焦显微镜应用药物进入细胞的动态过程及定位分布xyzt扫描第40页,共48页，2024年2月25日，星期天激光扫描共焦显微镜应用四.膜电位的测量标记膜电位探针(慢反应）：JC1510nm 530/590nmDioc5(3)548nm 573nmDioc6(3)484nm 500nm快反应探针：Di-4-ANEPPS496nm 703nmDi-4-ANEPPS498nm 713nm细胞膜静息膜电位：-70mV线粒体膜电位：-150mV以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针第41页,共48页，2024年2月25日，星期天激光扫描共焦显微镜应用七．荧光能量共振转移(fluorescenceResonanceEnergyTransfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子