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四川大学实验报告

题目：目的基因与载体的连接转化及工程菌导入表达并PCR验证。

一．实验目的:

1.学习目的基因连接转化载体的原理和方法。

2.学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和方法。

3.学习菌落PCR鉴定阳性克隆的方法和步骤

二．实验原理

1.DNA的连接重组：

具有相同粘性末端的段DNA分子在DNA连接酶的作用下可以连接在一起。因为相同的

粘性末端同一通过碱基互补配对形成一个相对稳定的结构。连接温度的选择，理论上的最适

温度是连接酶的最适温度37摄氏度，但是该温度下粘性末端形成的配对结构稳定，所以

在室温下（12~16度）既可最大限度发挥连接酶的活性，又有助短暂配对结构的稳定。

2.感受态细胞的制备：

将快速生长的大肠杆菌置经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞

膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分

核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易

与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。

联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高

100～1000倍。

3.质粒的导入

在冰上融化感受态细胞，经过42度短暂热激后，由细胞膜处液晶态产生裂缝，外源

DNA黏附细胞表面，而后立即冰浴，促使细胞膜愈合。然后将菌体放入适宜的培养基中培

养，以促进细胞的愈合恢复。

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4.阳性转化的培养基筛选方法。

普通的大肠杆菌难以在含有Kana的LB培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有Kana霉

素的抗性基因，所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有Kana的LB培养基上形成菌

落，即转化阳性，但是由成功导入的质粒不一定携带了目的基因，所以可能会出现伪阳

性，故需要进行PCR鉴定。

5.菌落PCR的原理

通过目的基因的引物进行菌落PCR，如果菌体成功导入了目的基因，则能够通过PCR获

取大量目的基因片段，而不含有目的基因的菌落不会扩增出目的基因片段。从而将阳性与伪

阳性菌落区分开。

三．实验材料及设备

1.实验材料：

（1）已完成酶切的载体与目的基因片段。DNA连接酶，缓冲液等。

（2）冰冻的感受态DH5a大肠杆菌。

2.实验仪器：

（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液

器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；

（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，

取液器，微波炉，凝胶成像系统。

（3）PCR仪

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3.实验试剂：

（1）质粒的转化与转化导入

a.DNA连接酶d.酶切后的pET28a、目的基因

片段等。

b.10Xbuffer;

c.卡那霉素；

e.LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）

5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5;

（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测

a.Goldview（DNA染料）

b.1×TAE缓冲液

c.上样缓冲液（6×buffer）

（3）PCR

a.loadingbuffer

b.四种脱氧核糖核苷酸原料、Taq酶、上下游引物

c.ddH2O

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四．实验方法及步骤

实验流程图

PCR鉴定菌落