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原代细胞的脂类染色方法苏丹红Ⅲ染色法原理:
苏丹红染料在脂类物质中的溶解度大于其在溶剂中的溶解度,如果染料与含有脂类的试样接触,便有大量染料进入脂类物质的结构内,使这些结构呈红色。多用苏丹红染料、油红O、尼罗蓝等溶于脂类的染料染色,使脂质呈色。也可用四氧化锇染色,脂肪酸或胆碱可使四氧化锇还原为二氧化锇而呈黑色。
配制试剂:
苏丹红Ⅲ染色液:将1g苏丹红Ⅲ溶于加温的70%乙醇溶液中过滤备用;
甲醛钙固定液:将10ml甲醛和1gCaCl2混合加水至100ml;
甘油明胶:将12g明胶加入120ml蒸馏水中水浴加热使其完全溶解,再加入60ml
甘油和1g苯酚,充分混匀后即得。于4℃储存备用;染色步骤:
用Hanks液漂洗盖玻片3次;
用甲醛钙固定液固定20min;
用蒸馏水漂洗盖玻片3次;
用70%乙醇将盖玻片冲洗3次;
用苏丹红Ⅲ染色液覆盖盖片样品,染色10―30min;
用70%乙醇漂洗盖片3次;
用甘油明胶封片后观察;结果:
原代细胞含脂类的区域呈橘红色;
1.
1.染色液的配制
材料:油红染料棕色可密封瓶异丙醇研钵漏斗定性滤纸
材料:油红染料棕色可密封瓶异丙醇研钵漏斗定性滤纸
称取预先研磨粉碎的
称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉,溶于少量异丙醇中,然后加异丙醇至100ml,棕色瓶密封(或锡箔
纸包裹避光)4℃保存,为储存液,可长期保存。用时取6ml加三蒸水4ml混匀,定性滤纸过滤,稀释后
数小时内用完。
数小时内用完。
2.10%
2.10%中性甲醛的配制
材料:中性甲醛(多聚甲醛)密封瓶
材料:中性甲醛(多聚甲醛)密封瓶
称取
称取1g中性甲醛粉末,加入10ml的三蒸水中,密封,在60度水浴中过夜才能溶解。配好的溶液1个
星期内有效,最好
星期内有效,最好4度保存。
3.
3.染色对象间充质细胞脂肪诱导后不同时间段。
4.
4.培养载体3毫升培养瓶。如果培养载体为塑料制品,hoechst33342染核的话,塑料板自发荧光也为
蓝色,必须考虑。
蓝色,必须考虑。
5.
5.染色步骤:
5.1
5.1先小心轻缓倒去培养夜。
5.2
5.2用pbs轻缓漂洗(不洗没问题)。
5.3
5.3加10%中性甲醛固定30min(实际固定时间过夜都没问题。固定液用95%酒精也可)。固定的是细
胞膜。
5.4
5.4稀释油红储存液,油红:去离子水=3:2,滤纸过滤,室温放置10min(除去一些杂质,染色结果更
清晰)。
5.5
5.5染色10min左右,加的体积覆盖住板底即可,如6孔加1.5ml,24孔加0.5-1ml(实际染色时间1
小时都可以
小时都可以)。
5.6
5.6脱色,用75%酒精/60%异丙醇漂洗,除去多余的染料(实际用其他平衡液洗也没问题,背景并不会
残留多少
残留多少)。
5.7
5.7复染,淡苏木染色1/5分钟,pbs漂洗(这一步不做也可,看试验需要,并且苏木素会把胞浆染红,
如要显示核,
如要显示核,hoechst33342也可以,浓度5微克/毫升染10分钟即可把核染上)。
5.8
5.8甘油明胶封片(封片后可长期保存)。
5.9
5.9显微镜观察。
注意事项:
注意事项:
脂肪油红染色,有的是动物
脂肪油红染色,有的是动物/人体脂肪组织切片,或细胞爬片。各有操作差异。以下是各论坛方法小结,不
全。
全。
1.
1.完全成熟饱满的脂肪细胞,容易破裂,脂滴泄漏,所以压片,切片都要考虑到这个问题。
2.
2.细胞爬片细胞溶液脱落,特别是脂滴大的。操作务要轻柔。不要把细胞冲掉。
3.
3.如果做脂肪组织冰冻切片,冰冻温度比普通要低,切片厚度加厚。
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