检验技术化学发光和荧光免疫技术及仪器.ppt

*常用标记物:ALP反应特点:①可采用竞争法和夹心法,多采用双抗体夹心法②采用磁性微粒作为固相载体，以碱性磷酸酶作为标记物，固相载体的应用扩大了测定的范围,检测水平可茯Pg·mL-1，重复性好。第31页,共47页，2024年2月25日，星期天*五、相关仪器介绍ADVIACENTAUR全自动免疫分析仪第32页,共47页，2024年2月25日，星期天*(一)ADVIACENTAUR检测原理利用化学发光和磁性微粒子分离技术相结合的测定方法，用高敏感性的吖啶酯作为化学发光标记物，以极细的磁性颗粒(PMP)作为固相载体，提供最大的包被面积。1．液相吖啶酯(AE)。2．固相氧化铁(Fe2O3)。包被面积大,减少了扩散时间,增加了捕获效率第33页,共47页，2024年2月25日，星期天*(二)ADVIACENTAUR的反应类型1．双抗体夹心法第34页,共47页，2024年2月25日，星期天*2．竞争法包括AE标记抗原法和AE标记抗体法。第35页,共47页，2024年2月25日，星期天*3．捕获法常用来检测样本中的特异性抗体，又称为抗体捕获法。试剂中使用了一种抗人免疫球蛋白的抗体。抗体捕获法通常使用两次温育和洗涤，第一次温育和洗涤是为了除去样品中过多的干扰物质；第二次温育和洗涤是为了检测样品中的抗体。第36页,共47页，2024年2月25日，星期天*第二节电化学发光免疫分析电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)是对电极施加一定电压进行的电化学反应，反应的产物之间或体系中某种组分发生化学发光，用普通化学手段测量发光光谱及强度从而对物质进行痕量分析的一种方法。电化学发光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)是将ECL和免疫反应(抗原抗体反应)融为一体的标记免疫分析技术,是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应.第37页,共47页，2024年2月25日，星期天*一、基本原理第38页,共47页，2024年2月25日，星期天*技术特点1．ECLIA为非核素方法，可避免核素的放射性污染2．为均相免疫测定技术，检测中不需要分离结合相和游离相，操作简便3．磁性微珠包被技术的应用使检测的灵敏度更高、线性范围更宽、反应时间更短。4．标记物Ru稳定性好，室温下半衰期大于1年，所标记的蛋白活性在2～4℃也可保持1年：以上。5．标记物可进行化学修饰，以形成易于和蛋自、半抗原及核酸等分子结合的活性NHS酯或磷酰胺基团，可用于各种分析物的检测。6．标记物相对分子质量小，在一个抗体分子上可同时标记许多标记物分子而不影响抗体的免疫学活性，也可用于核酸的标记而不影响探针的杂交活性。7．标记物的再循环利用使发光反应的时间更长、发光强度更高，更易于测定。8．仪器的没计使操作较为简便，更易于实现自动化。第39页,共47页，2024年2月25日，星期天*二、标记物钌的衍生物，分子结构简单、稳定、相对分子质量小、水溶性强、空间位阻小等特点，可与待测物质进行全量反应．使得ECLIA的测定具有高效性与稳定性且没有噪声干扰。三联吡啶钌第40页,共47页，2024年2月25日，星期天*第三节时间分辨荧光免疫分析法一、基本原理抗原抗体反应荧光物质标记时间分辨技术++原理：第41页,共47页，2024年2月25日，星期天*用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物(代替荧光物质、放射核素或酶)，通过双功能基团的螯合剂与蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞以共轭双键结合进行标记，待反应体系(如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后，三价稀土离子螫合物可以在紫外光激发下，发出强度高(波长为613nm左右)、持续时间长(10～l000μs)的荧光，利用延缓测量时间，待样品中蛋白质等背景荧光完全淬灭后，再测量三价稀土离子螯合物的特异荧光，根据荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的第42页,共47页，2024年2月25日，星期天*时间分辨技术消除背景荧光:在检测样品中，含有各种蛋白质和其他化合物，这些物质在较大波长范围内都可产生自发荧光,寿命短.镧系离子荧光寿命很长（10us～1.0ms），比背景荧光长3～4个数量级。所以应用荧光的时间分辨技术在背景荧光已经降到很低时再开始检测稀土鳌合物的荧光，从而消除了非特异性