提取基因组和原理.ppt

6X上样缓冲液（Loadingbuffer）组成：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青、40%蔗糖作用：能够增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内；能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色和蓝色指示带，从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。第63页,共72页，2024年2月25日，星期天溴化乙锭（EB）（染色剂）核酸电泳后，需要染色才能在紫外线下观察到带型。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，有剧毒，因此操作时要非常小心。EB可嵌入DNA双链的碱基之间，在紫外线激发下能发出橙红色荧光，见光易分解,棕色瓶保存于4℃,使用终浓度0.5μg/mL。第64页,共72页，2024年2月25日，星期天三、操作步骤1、选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。2、用透明胶带纸将tank两端封好，选择孔径大小适合的梳板，垂直架于tank的一端。3、制备琼脂糖凝胶，称取适量琼脂糖，溶解在0.5XTBE中,置微波炉中加热,均匀溶解琼脂糖。第65页,共72页，2024年2月25日，星期天4、加入EB（0.5μg/mL），摇匀，待凝胶冷却至50℃左右，倒入tank中，室温下冷却凝固。避灭产生气泡。5、撕去两端的透明胶带纸，将tank和凝胶一起放入电泳槽内。在电泳槽内加入0.5XTBE，使缓冲液盖过胶面，小心取出梳板，保持点样孔的完好。第66页,共72页，2024年2月25日，星期天6、待测的DNA样品与1/5体积的上样缓冲液混匀后点样，记录上样次序及点样量，在样品的左侧点样孔加入分子量标准。7、打开电源开关，选择适当电压（不超过5V/cm。8、电泳至所需位置，停止电泳。9、取出凝胶到紫外投射仪或凝胶成像系统观察或照相。第67页,共72页，2024年2月25日，星期天

注意事项A使吸管与加样孔垂直，使吸管尖端刚好在加样孔开口之下，缓慢将DNA样品加入加样孔中。B加样完毕后，正确连接电泳槽和电源（黑的连阴极，红的连阳极）。将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑末端），注入适量的TBE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm，加溴化乙锭（EB）至TBE缓冲液中并使之混匀（EB的终浓度是1μg/mL）。EB也可加到胶中，即将琼脂糖在微波炉中加热，然后冷却至50℃，再加入EB。第68页,共72页，2024年2月25日，星期天C通过检查加样孔附近黑末端的铂线来检测线柱是否连接良好。若连接良好，负极附近的铂丝会有气泡产生。D电泳过程要进行一个合适的时间。电泳时间的选取取决于胶的长度和电压大小。胶越长，电压越低，所需时间越长。然而使用高压时，大的DNA片段的分辨率很低。第69页,共72页，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺凝胶电泳一原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂N,N‘-亚甲双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵或核黄素作用下聚合交联而成的三维网状结构凝胶.聚合反应需要有催化剂参加,催化剂包括引发剂和加速剂.引发剂:硫酸铵或核黄素.加速剂:N,N,N,N‘-四甲基乙二胺.第70页,共72页，2024年2月25日，星期天常用的聚丙烯酰胺凝胶:1非变性聚丙烯酰胺凝胶:用于分离和纯化双链DNA片段.无法确定双链DNA大小.2变性聚丙烯酰胺凝胶:用于分离和纯化单链DNA片段.变性DNA在凝胶中的迁移率几乎与碱基组成及序列完全无关.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶:用于分离和纯化蛋白质.第71页,共72页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第72页,共72页，2024年2月25日，星期天2引物和模板DNA的复性：复性温度过高，寡核苷酸引物不能与模板很好复性，扩增效率降低；复性温度太低，非特异性DNA片段扩增增加。3寡核苷酸引物的延伸：常在热稳定DNA聚合酶的催化DNA合成的最适温度下进行。对TaqDNA聚合酶来说最适温度是72~78℃。第31页,共72页，2024年2月25日，星期天PCR反应特点特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低第32页,共72页，2024年2月25日，星期天特异性强关键：引物与模板的正确结合引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高第33页,共72页，2024年2月25日，星期天PCR反应的特异性决定因素引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；