转g10epsps基因耐除草剂大豆ZUTS33转化体特异性检测方法的建立.docx

转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33转

化体特异性检测方法的建立

近年来,随着基因工程技术的飞速发展 ,转基因作物种植面积和转基因作物品种都大幅增加。根据国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisition

of Agri-biotech Applications,ISAAA) 发布的2018年全球生物技术/转基因作物发展态势报告 ,2018年全球共有26个国家或地区批准了转基因作物的种植 ,44个国家或地区批准了转基因作物作为加工原料进口 ,转基因作物的种植面积达1.917亿hm2[1]。转基因大豆作为最主要的转基因作物 ,全球种植面积达 9 590万hm2,占全球转基因作物种植面积的50%[2]。随着转基因产业的高速发展 ,全球已有60多个国家或地区相继实施了转基因产品定量标识阈值管理 ,其中,欧盟将转基因成分标识阈值设定为 0.9%,日本设为5%,韩国设为3%[3-4]。我国自2001年起也先后颁布了《农业转基因生物安全管理条例》《农业转基因生物标识管理办法》 ,明确规定了我国对所有的转基因食品实行零容忍定性标

识管理制度。因此,转基因安全管理实施定量标识和阈值管

理是发展的必然趋势[5]。而建立快速、精准的转基因定量检测方法体系可以为实现转基因产品标识阈值管理制度、规范转基因产品销售行为、保护消费者的知情权、加强农业转基因生物安全管理提供技术支持。

PCR技术具有灵敏度高、稳定性好、准确性强、操作简便的优势,是国际上转基因植物及其产品检测的主要方法。特别是实时荧光定量PCR技术,因具有更高的灵敏度、更强的特异性和准确性、检测过程耗时短且能实现高度自动化等特点,近年来被广泛应用于转基因作物的检测 [6]。目前针对大豆、水稻、玉米等作物的特定转基因品系的实时荧光定量PCR检测方法已陆续研发成功 [7-12]。

转基因耐草甘膦大豆 ZUTS-33是由浙江大学利用农杆菌介导法转化栽培大豆华春 3号获得的,ZUTS-33可产生G1

0-EPSPS蛋白,对草甘膦高抗,可以满足大豆种植者对田间杂草的有效防治,具有较好的农艺性状和商业化潜力 [13]。但到目前为止,尚未发布专门针对转基因耐除草剂大豆 ZUTS

-33转化体及其衍生品种的检测方法。本研究以转 g10-epsps基因耐除草剂大豆 ZUTS-33为研究对象,设计转g10-epsps

基因耐除草剂大豆ZUTS-33的转化体特异性检测引物和Ta

qMan探针,利用优化的实时荧光定量PCR检测方法评价该引物对和探针的特异性、准确度、精确度和重复性,并确定此检测方法的检测极限(limitofdetection,LOD)和定量极限(limitofquantity,LOQ),以期建立转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33品系的检测鉴定方法,为农业转基因生物安全管理提供技术支持。

材料与方法

材料

试验材料

试验所用转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33及其受体材料由浙江大学提供;其他转基因大豆混合物(GTS40-3-2、MON89788、CV127、A5547-127、A2704-12、30542

3、356043、MON88302、73496、MON87769、MON8770

5、FG72、DAS68416-4、SHZD32-1),转基因玉米混合物(Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、双抗12-5、IE09S034、C0030.3.5、C0010.3.7、4114、MON87427、5307),

转基因棉花混合物(MON531、MON1445、MON15985、L

LCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102),转基因油

菜混合物(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、OXY235、Topas19/2、MON88302、73496),转基因水稻混合物(TT51-1、科丰6号、克螟稻、M12、科丰8号、科丰2号、G6H1、T1C-19)阳性材料购置于深圳卓越生物科技有限公司和农

业农村部科技发展中心;其他非转基因玉米、大豆、水稻、

棉花等材料由本实验室自备。

主要试剂

TaqManFastAdvancedMasterM