DB2306T 185-2023 牛呼吸道疾病综合征病原PCR检测技术规范.docx

ICS65.020.30CCS

ICS

65.020.30

CCS

B41

黑 龙 江 省 大 庆 市 地 方 标 准

DB2306/T185—2023

牛呼吸道疾病综合征病原PCR检测技术规范

2023-12-31发布 2024-01-31实施

大庆市市场监督管理局 发布

DB2306/T185—2023

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目 次

前言 II

范围 1

规范性引用文件 1

术语和定义 1

环境与设施 1

仪器设备 1

试剂与材料 2

样本前处理与核酸提取 2

扩增体系与反应条件 2

附录A（规范性） 病料采集和常规处理 9

参考文献 10

前 言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由大庆市农业农村局提出并归口。

本文件起草单位：黑龙江八一农垦大学、黑龙江农业职业技术学院、双鸭山市农业技术综合服务中心。

本文件主要起草人：朱战波，周玉龙，刘宇，张泽财，韩天惠，刘云，卢群，于立权，马金柱，陈楠楠，阙桃林，倪宏波，闻晓波，张晓轩，侯喜林，崔玉东

DB2306/T185—2023

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牛呼吸道疾病综合征病原PCR检测技术规范

范围

本文件规定了牛呼吸道疾病综合征病原PCR检测技术的环境与设施、仪器设备、试剂与材料、样本前处理与核酸提取、扩增体系与反应条件等要求。

本文件主要适用于牛呼吸道疾病综合征主要病原的PCR检测和分子鉴定。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T18637 牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范

GB/T27981 牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法

NY/T

541

兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T

3234

牛支原体PCR检测方法

SN/T

1129

牛病毒性腹泻/粘膜病检疫技术规范

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

牛呼吸道疾病综合症bovinerespiratorydiseasecomplex，BRDC

由多病原引起牛的一类呼吸系统感染损伤的疾病总称。通常由应激、原发性病毒感染和继发性细菌感染引起，导致牛的高发病率和死亡率。

环境与设施

实验室资质及级别要求

具有与采集病料相适应的动物病原微生物实验室条件和生物安全防护水平相适应的设备，以及防止病原感染和扩散的有效措施。

操作人员资质及防护要求

操作人员有从业资质，符合上岗要求。

仪器设备

生物安全柜、4℃离心机、PCR仪、漩涡震荡器、水平电泳仪、凝胶成像系统、恒温水浴锅、实时荧光定量PCR扩增仪等。

试剂与材料

试剂

核酸提取试剂盒、反转录试剂盒、脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）、PCR缓冲液、RNA酶抑制剂、细菌总DNA提取试剂盒、PBS溶液、TrizolReagent试剂、无水乙醇、超纯水等。

材料

玻璃平皿，玻璃烧杯（100mL、500mL、1000mL），量筒（100mL、200mL、500mL、1000mL）、镊子（含弯头镊子），手术刀，组织研磨棒，剪刀（含弯头剪刀），载玻片，酒精灯，移液枪（10μL、200μL、1000μL）等。离心管（1.5mL、2mL、15mL、50mL），采样管（5mL），移液器吸头（10μL、200μL、1000μL），棉拭子，注射器（5mL、10mL、20mL），一次性采血管（含针头），PCR管（200μL）等。

样本前处理与核酸提取

样本前处理

样本采集遵循NY/T541的规定，见附录1。

核酸提取

按RNA或DNA核酸提取试剂盒说明书操作。

扩增体系与反应条件

牛传染性鼻气管炎病毒

聚合酶链反应（PCR）检测

引物

选择IBRV的gI糖蛋白基因区序列设计引物，序列如下：

上游引物：5ˊ-CACGGACCTGGTGGACAAGAAG-3ˊ(624-645)

下游引物：5ˊ-CTACCGTCACGTGAGTGGTACG-3ˊ(1070-1091)

目的片段大小468bp。

操作步骤

扩增体系：上、下游引物各50pM，脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）20mM，PCR缓冲液

（MgCl250mM