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支原体菌株复苏操作规程
部门/职务
姓名
签字
日期
起草人
审核人
批准人
批准人
生效日期：【年月日】
颁发部门
分发部门
1目的
建立规范支原体菌株复苏的标准操作规程，确保支原体复苏质量和活率。
2范围
适用于本公司的支原体菌株复苏操作。
3职责
4定义
无
5内容
5.1仪器设备
5.1.1生物安全柜、恒温培养箱、移液枪、高压蒸汽灭菌器、混匀仪、水浴锅（56℃）、电动移液器。
5.2试剂及耗材
5.2.11000uL枪头、灭菌试管、灭菌胶塞、血清、支原体肉汤培养基、精氨酸支原体肉汤培养基、10mL刻度移液管。
5.3准备工作
5.3.1将胎牛血清在56℃水浴锅中水浴1小时，灭能。
5.3.2将试管用锡纸包裹好试管口，将胶塞放进饭盒，经过121℃，30分钟，进行高压蒸汽灭菌。
5.4培养基配制
5.4.1支原体肉汤培养基：21g干粉培养基，加1L纯水，加热到溶解，121℃，15分钟高压蒸汽灭菌。
5.4.2精氨酸支原体肉汤培养基：21g干粉培养基，加1L纯水，加热到溶解，121℃，15分钟高压蒸汽灭菌。
5.5操作步骤
5.5.1生物安全柜提前开启紫外灯消毒30分钟，培养基经灭菌，待温度下降到45℃以下。
5.5.2将培养基分装，每支试管8mL，加入2mL灭能血清，混匀
5.5.3若为零代将菌种从-4℃冰箱取出，用75%酒精进行表面消毒喷，用无尘布擦拭干净后，放入生物安全柜内，用止血钳将铝盖打开。（注意：将所有有关菌株的物品禁止随意丢弃，防止发生污染与泄露）。
5.5.4若菌株为零代菌种肺炎支原体用1.0mL支原体肉汤培养基轻轻地旋转冷冻管以充分混合并完全溶解,若菌株为零代菌种口腔支原体用1.0mL精氨酸支原体肉汤培养基轻轻地旋转冷冻管以充分混合并完全溶解。
5.5.5将溶解混合好的肺炎支原体、口腔支原体0.5mL分别接种于9.5mL支原体肉汤培养基和9.5mL精氨酸支原体肉汤培养基中混匀，经36℃±1℃培养至肺炎支原体培养基由橙红色变为橙黄色，传代，口腔支原体培养基由橙黄色变为橙红色，可传代。
5.5.6若为冻存后的菌种从-80℃冰箱取出，用37℃水浴溶解后，转移到传递窗内，用75%酒精进行表面消毒喷，用无尘布擦拭干净后，转移到生物安全柜内，用止血钳将封口膜撕开，打开冻存管。（注意：将所有有关菌株的物品禁止随意丢弃，防止发生污染与泄露）。
5.5.7溶解后的菌种直接用微量移液枪转移到相应的培养基内，混匀。肺炎支原体用9.0mL支原体肉汤培养基，口腔支原体用9.0mL精氨酸支原体肉汤培养基。
5.5.8经36℃±1℃培养至肺炎支原体培养基由橙红色变为橙黄色，传代，口腔支原体培养基由橙黄色变为橙红色，可传代。
6派生记录
6.1《支原体菌株复苏记录》
7相关文件
无
8参考依据
ATCC15531和ATCC23714说明书
9修订记录
版本号
修改内容
修订人
生效日期
1.0
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