微生物学新技术在环境领域中的应用.ppt

不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。一旦DNA片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA片段最低的解链区域解链，部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，不同的DNA片段会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。第31页,共44页，2024年2月25日，星期天然而，当变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹子，一般30-50个碱基对）可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中每个碱基处的序列差异都能被区分开。第32页,共44页，2024年2月25日，星期天第33页,共44页，2024年2月25日，星期天当用DGGE/TGGE技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerasechainreaction）扩增技术，用PCR扩增的16SrDNA产物来反映微生物群落结构组成。通常根据16SrRNA基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5’-端含有一段GC夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE/TGGE分析。由于DGGE/TGGE一般只能分析500bp以下的DNA片断，所以一般选择扩增16SrRNA基因的V3区或V6-V8区。第34页,共44页，2024年2月25日，星期天16SrDNA的高可变区E.coli16SrRNA二级结构及各可变区V3区约170bpV6-V8区约350bp片段大小不同，携带的信息量不同，选择不同的区域得到DGGE图谱不同，群落信息也有差异不同的片段大小对应的胶浓度也不同根据需要选择最合适的提取基因组后，扩增16SrDNA高可变区片段第35页,共44页，2024年2月25日，星期天确定合适的变性剂范围对DNA片段进行有效分离根据变性剂梯度方向与电泳方向相同或不同,DGGE分为：垂直DGGE平行DGGE第36页,共44页，2024年2月25日，星期天常规的DGGE电泳技术对于长度超过500bp的DNA片段的序列变化情况,只能有50%的检出率。应用“GC夹板”技术可使检出率提高到100%。当等长的双链DNA分子在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时,因其解链的速度和程度与其序列密切相关;部分解链的DNA分子的迁移速度随解链程度增大而减小。GC-Clamp16SrDNA低浓度高浓度第37页,共44页，2024年2月25日，星期天DGGE的参数：胶浓度取决于片段大小，通常不宜超过500bp6%胶浓度：400～1000bp8%胶浓度：200～400bp10%胶浓度：100～300bp变性剂范围不同的样品不同温度一般都用60摄氏度电压时间第38页,共44页，2024年2月25日，星期天第39页,共44页，2024年2月25日，星期天环境样品分析的流程第40页,共44页，2024年2月25日，星期天DGGE在微生物分子生态学中的应用对微生物群落结构进行对比、分析或者跟踪监测。通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的多样性。跟踪及检测细菌的富集和分离，评价不同的培养条件对分离菌种的影响。第41页,共44页，2024年2月25日，星期天举例：油藏古细菌V3区DGGE图谱胶浓度：10%变性剂范围：40%-60%电压：200V运行时间：4.5h第42页,共44页，2024年2月25日，星期天优点：重现性强，可靠性高，方便快捷而且使用成本低。能同时分析多个样品，使其非常适于分析环境样品中微生物群落结构的变化。缺点：分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），只能检测出优势菌。一般只能分析500bp以下的片段。PCR过程产生的异源双链和单链DNA会对分析造成偏差。第43页,共44页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第44页,共44页，2024年2月25日，星期天**