实验动物胚胎工程技术.ppt

*四、诱导性多潜能干细胞1.iPS细胞的来源iPS细胞建立的过程主要包括:①分离和培养宿主细胞；②通过病毒介导或基因转染的方式将若干个多能性相关的基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）导入宿主细胞；③将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上,用ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养液中根据需要加入相应的小分子化合物，以促进重编程。2.iPS细胞的培养和诱导定向分化其培养条件和诱导定向分化的条件基本与ES细胞相同。3.iPS细胞的鉴定iPS细胞的鉴定与ES细胞相同。第53页,共71页，2024年2月25日，星期天*如何获得人ES细胞传统技术1.用病人的皮肤细胞核移植到人去核卵母细胞人卵母细胞来源问题2.用病人的皮肤细胞核移植到动物去核卵母细胞伦理问题新技术1.用ES细胞特异转录基因导入人皮肤细胞，直接转化成诱导多能干细胞（iPS）(2007年）安全问题2.miRNAs直接将皮肤细胞转化为iPS(2010年）以病毒为载体，向老鼠的成纤维细胞中注入4个基因，将其改造为ｉＰＳ细胞，然后在此基础上培育出一个老鼠胚胎，再把它植入代孕实验鼠的体内。20天后，一只黑色的小老鼠出生。第54页,共71页，2024年2月25日，星期天*4.iPS细胞的应用iPS细胞与ES细胞相比,具有很多优势。iPS细胞的来源更方便、更丰富，可以通过有限的几个转录因子基因转染直接诱导各种不同动物的体细胞来获取多能性干细胞，而不需要通过ES细胞途径，克服了许多动物至今未分离出ES细胞的问题。iPS细胞的产生不需要早期胚胎或者其他配子的参与，克服了使用人胚胎进行实验的伦理问题，可见iPS细胞必然成为未来相当长一段时间内的研究热点。目前,科学家们已经成功地从小鼠、大鼠、猕猴、猪和人的体细胞中诱导并获得iPS细胞。第55页,共71页，2024年2月25日，星期天*第五节外源基因导入胚胎技术

第56页,共71页，2024年2月25日，星期天*将外源基因导入到胚胎内主要有以下几种方法：一、直接导入受精卵或早期胚胎内①显微注射法：在显微镜下利用玻璃显微注射针将外源DNA直接注入到受体的受精卵雄性原核内。②逆转录病毒载体法：将外源基因克隆到逆转录病毒载体，感染受体细胞时，外源基因可整合到宿主细胞染色体内。用于转基因和基因治疗。③精子载体法：将外源DNA与动物精子一起孵育，在体外受精过程中由精子将外源DNA带入卵内。第57页,共71页，2024年2月25日，星期天*二、将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞，再将转染的细胞作为供体核移植到去核卵母细胞，发育成胚胎。1.将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞：①电穿孔法：细胞暴露于高电压时，细胞膜为高电压瞬时击穿，从而使外源DNA被摄入细胞中。②脂质体法：脂质体是一种人造膜，将外源DNA装入脂质体，与培养细胞一起温育，即可将外源DNA导入受体细胞。③基因枪法：④DEAE-葡聚糖介导法：⑤磷酸钙介导法：第58页,共71页，2024年2月25日，星期天*2.带有外源基因的ES细胞通过崁合体技术进入囊胚胚胎嵌合是指将遗传上不同的两类胚胎或胚细胞组合起来，由此而发育形成的动物称为嵌合体动物。由于嵌合体动物是两类遗传背景不同的胚胎发育形成的，不同细胞群体互相嵌合构成了器官和组织，但嵌合体动物携带的两种遗传特性不能同时遗传给下一代的同一个体。究竟哪一个亲本的遗传特性能遗传取决于该亲本的细胞是否在嵌合体动物体内分化成生殖细胞（精子或卵子）。分化成生殖细胞的亲本的遗传特性能传给后代。第59页,共71页，2024年2月25日，星期天*嵌合体动物的制备：1.聚合法用聚合法制作嵌合体动物，是将遗传上不同（例如毛色不同）的两个8～16细胞胚胎用物理方法聚合起来。2.注射法注射法是将胚胎干细胞或其他胚细胞注入桑椹胚或囊胚腔中来制作嵌合体动物。第60页,共71页，2024年2月25日，星期天*3.带有外源基因的体细胞通过克隆技术进入胚胎将带有外源基因的体细胞作为供体，通过核移植技术克隆到去核卵母细胞，在体外发育成囊胚，再移植到假孕动物的子宫中。出生后动物的基因型与供体的基因型完全一致。第61页,共71页，2024年2月25日，星期天*外源基因进入细胞后的命运外源DNA进入细胞后有三种命运：1．被胞内酶降解。2．以游离状态存在。游离的未整合外源DNA只要有真核细胞能识别的启动子、编码基因以及poly(A)信号等，一般都能得到表达，但随着细胞衰老，表达力下降。这种表达不