PCR技术的原理与方法.pdfVIP

PCR技术的原理与方法

浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。

Mg2能影响反应的特异性和产率。

（三）BSA：普通用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。

（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，普通存储

浓度为10mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但

同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。

（五）Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，普通用

72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP份子连接

到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功

能。某种dNTP或者Mg2浓度过高,会增加其错配率。用量普通为0.5～5个单位/100μl。

（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质

存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。

模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。

（七）引物：引物浓度普通为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得

产量过低。引物长度普通～个碱基，引物过长或者过短都会降低特异性。其3’末端

不到产物或者1530

一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引起链的延伸）。

引物GC约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或者嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链

存在，不能与非目的扩增区有同源性。

•PCR反应条件的选择（影响因素）

•温度参数：

1.变性：模板变性彻底与否是PCR成功的关键，普通先于94℃（或者95℃）变性3～10min，接着9

4℃变性30～60s。

2.退火：退火温度普通低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(GC)×4℃

(AT)×2℃计算退火温度，普通退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(GC)低于50%，

退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。

3.延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，普通在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合

酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。

循环数：

PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，普通20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特

异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。

PCR产物积累规律：

反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，

产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、

PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。

•PCR扩增仪

PCR常见问题

一.没有扩增产物

1.循环温度：变性温度、退火温度

2.引物设计

3.DNA聚合酶活性

4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份)

5、DNA样品

二.非特异产物及电泳呈涂布状

1.Mg2浓度

2.调整引物、模板、聚合酶的用量

3.适当减少循环数

4.适当提高退火温度，缩短退火或者延伸时间

•三.引物二聚体的形成

1.检查引物的序列

2.提高退火温度

3.调整引物与模板浓度

4.增加引物长度

•四.假阳性结果的预防

1、实验器材应一次性使用(吸咀、PCR管)

2、注意操作环境，戴一次性手套

3、严格PCR操作规程

4、多次取样的试剂应分装

5、设置阴性对照和阳性对照

PCR相关技术

一.锚定PCR(anchoredPCR)：

•引进锚定引物，可以匡助克服序列未知或者序列未全知的障碍。

•在DNA3’-末端加之pol