基因诊断与基因治疗.ppt

**逆转录病毒结构:基因组组成：（1）5’－帽子；3’－尾巴；（2）每个单链RNA含6个区：5’-LTR（长末端重复序列）Ψ+（组装所需的非编码序列）gag（编码衣壳结构蛋白基因）pol（编码反转录酶基因）env（编码外壳蛋白基因）3’-LTR第94页,共110页，2024年2月25日，星期天**逆转录病毒生活周期:1、感染靶细胞2、利用自身编码的逆反转录酶，以RNA为模板合成DNA。3、将病毒DNA转运至宿主细胞核4、病毒DNA整合到宿主染色体5、以病毒DNA为模板转录RNA6、在细胞中翻译Gag、Pol和Env蛋白7、形成衣壳，RNA单链和反转录酶一起包装进衣壳。8、形成病毒颗粒并分泌到胞外。第95页,共110页，2024年2月25日，星期天**逆转录病毒病毒RNA宿主细胞RTRT逆转录酶cDNA双链插入基因组DNA逆转录病毒感染过程病毒RNA第96页,共110页，2024年2月25日，星期天**构建逆转录病毒载体：（1）构建重组野生性病毒：插入相关外源基因，改造成DNA载体（包括插入选择性标记），替代病毒的编码基因。（2）制备辅助细胞（293T细胞），为载体DNA提供其丧失的功能。（3）载体DNA导入辅助细胞，产生病毒载体。（4）用病毒载体感染细胞，外源基因在宿主细胞中表达。第97页,共110页，2024年2月25日，星期天**逆转录病毒载体的缺陷：1、只能转染处于增殖状态的细胞2、所携带的外源基因不能太大。3、感染依赖靶细胞表面受体的限制4、理论上不扩散其它细胞，但某些情况会造成野生型病毒爆发。5、有致细胞癌变的可能。6、逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩过程。第98页,共110页，2024年2月25日，星期天**腺相关病毒(AVV)一种小的、非致病的、单链DNA病毒。是从属病毒，需要其他基因才能复制。结构：rep基因－－编码病毒的复制、整合功能所需蛋白cap基因－－编码病毒结构组分ITRs序列－－反向末端重复，定义基因的开始和结束，制约DNA序列大小，包裹入衣壳。细胞对AVV病毒的亲和力高，AVV载体适用范围广泛。第99页,共110页，2024年2月25日，星期天**骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞选择原则:1、较坚固，耐受处理，易于由人体分离，便于输回体内。2、具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月或几年，至病人的整个生命。3、易于受外源遗传物质的转化。4、在选用病毒载体时，目的基因的表达最好具有组织特异性的细胞3、选择靶细胞（禁止使用生殖细胞，只能用体细胞）第100页,共110页，2024年2月25日，星期天**1、骨髓细胞：最被重视和常用的靶细胞。常用细胞：优点：⑴易接受各种处理、⑵已积累丰富经验，⑶多数遗传疾病涉及骨髓细胞、⑷源自骨髓的细胞遍布全身。缺点：-骨髓干细胞含量少（占骨髓细胞0.1%）-治疗基因在核骨髓细胞表达时间短（几个月）。-只有部分干细胞有活性-造血干细胞分化可能导致基因失活。-有些遗传疾病与骨髓干细胞无关。2、肝细胞：是许多遗传代谢缺陷的靶细胞。3、皮肤细胞：易于繁殖及转化。4、淋巴细胞：易采集、分离，大量繁殖，连续多次输入5、癌细胞：肿瘤治疗常用细胞。第101页,共110页，2024年2月25日，星期天**方法：1、物理法：显微注射法电穿孔法基因枪技术2、化学法：磷酸钙沉淀法DEAE-葡萄糖法脂质体法3、融合法4、病毒感染法4、基因的转移第102页,共110页，2024年2月25日，星期天**转染细胞后的筛选：方法：1、标记基因筛选法：2、基因缺陷型受体细胞的选择性3、基因共转染技术4、分子生物学方法:原位杂交Southern杂交斑点杂交目的基因或标记基因作为探针。第103页,共110页，2024年2月25日，星期天**方法：（目的基因和标记基因的表达）原位杂交、Northern杂交、RNA点杂交