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引物、探针设计一般性原则
概念引物：一段寡核苷酸序列，其3’端为PCR(polymerasechainreaction）的起点。分上游（正向）、下游（反向）引物，而扩增产物（扩增子）的长度就是由上下游引物的位置决定探针：一段经修饰寡核苷酸序列，用来实时监控扩增产物的量。位于上或下游引物下游，通常紧贴引物。
引物设计原则与靶区域互补匹配长度18~25bpGC含量40%~60%Tm值通常60±5℃避免连续4个及以上碱基出现，尤其是G四联体避免过多的二级结构，如二聚体、发卡结构3’端严格匹配上下游引物Tm值相差不超过1℃
探针设计原则与靶区互补匹配确保靶区域高度保守，若保守序列不够长，先设计探针探针长度20~28bpTm值比引物通常高10℃，为70℃左右5’避免G碱基，因为其具有淬灭荧光的能力避免4个及以上重复碱基出现避免过多二级结构确保C碱基数多于G碱基数，否者取其互补链
总体原则先设计探针，再设计引物探针绝对保守，严格匹配一般而言，引物探针无法完全避免二级结构，可允许二聚体出现，尽量保证ΔG绝对值小于5引物、探针设计好坏的根本在于序列比对（SequenceAlignment），序列比对成功引物、探针设计基本完成，使用相应的软件即可软件得出分高的未必就好，分低的未必不好，具体还需从实验结果判定
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