大肠杆菌全蛋白提取.pdf

（一）大肠杆菌的培养及暴露

(1)LB培养基的配制：

胰化蛋白胨（Trypton）：10g/L

酵母提取物（YeastExtract）：5g/L

NaCl：10g/L

DI水：800L溶解（PH=7.4）

定容至1L。

配三个固体培养基：150ml+2.5g琼脂粉（Agar）

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5g个液体培养基：100ml，灭菌120Ｃ，15min。

（2）细菌的培养：

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37Ｃ，220rpm/min,培养9h。

（3）碳管暴露：

方案一：分别取大肠杆菌对数期混悬液20ml,分装；离心（5000χg，15min）；

对照组加9ml的新培养基+1ml的生理盐水；实验组加9ml新培养基+1ml灭菌的1000ppm

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的S-MWNTS;37Ｃ，220rpm/min,培养2h。

方案二：

（二）总蛋白的提取

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（1）分别取对照和暴露后的大肠杆菌对数期混悬液10ml,离心（5000χg，4Ｃ，15min）；用

PBS(PH:7.4)清洗三边，取沉淀。

（2）按1/10加入裂解液对蛋白进行裂解

裂解液：（-20保存）

8M尿素、4%CHAPS、2%Bio-Lyte、40mMDTT

尿素4.8g

CHAPS0.4g

DTT0.0617g

Bio-Lyte1mL（20%的Bio-lyte）

定容至10mL，分装，-20保存。

PMSF（100mM/L）:（-20保存）

PMSF0.1742g

异丙醇10ml

分装，-20保存。

注：用含PMSF(1mM/L)的裂解液!

(3)超声冰浴：35%—40%，5s/10s,30min

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(4)分装离心：14000Χg,4C，20min

(5)取上清，分装500uL（-80保存）

(6)蛋白浓度的测定

标准蛋白：BSA1mg/mL

溶剂：DI水

分别取5、10、20、40、60、80、100、120uL

加同等体积的裂解液，用DI水定容至1mL.

样品：分别取对照组和暴露组蛋白上清液50uL用DI水定容至1mL.

分别取50uL加入到96孔板内，加200uL的考马斯亮蓝（G-250）染色2min后测OD值，

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绘制标准曲线，计算蛋白浓度。

（三）SDS凝胶电泳

1.配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。配15ml凝胶溶液，每块凝胶5ml，将溶液分别注入玻璃

板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。

聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。

2.待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

加入已配好的浓缩胶（5%）。

3.用SDS样品处理液将蛋白稀释为1mg/ml，上样量15μl。

4.电泳：起始电压50V，走下浓缩胶后加大电压150V。

第二章SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.1溶液的配制

30%聚丙烯酰胺贮液

丙烯酰胺150g

甲叉双丙烯酰胺4g

MilliQ水500ml

滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。

1.5mol/LTris碱pH8.8

Tris碱90.75g

MilliQ水